基于网络药理学及分子对接技术探讨仙灵骨葆胶囊治疗骨质疏松症的潜在机制※

赵灿斌,郭超,李晓阳,闫小龙,管东辉

(1.山东中医药大学,山东 济南 250014;2.山东中医药大学附属医院,山东 济南 250000)

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以骨小梁减少、骨量降低、骨皮质变薄为主要特征,易致骨脆性增加的全身性代谢性骨病[1]。随着社会经济的不断发展,我国OP患者的数量逐渐上升,该人群因骨密度下降、骨强度降低,更易在损伤中发生骨折。西医治疗OP包括降钙素、甲状旁腺素、维生素D等药物[2]。然而对于特定西药治疗OP的实验结论的普适性有待商榷。相比西药,中药尤其是中药复方有多层次、宽领域的治疗及调节作用,在防治OP的过程中具有较大的优势。

OP在中医中归属“骨痿”(《素问·痿论》)、“骨枯”(《素问·玉机真脏论》)、“骨痹”(《素问·长刺节论》)之类。中医认为,五脏中的肾与骨的生长发育及生理功能密切相关。肾藏精,精生髓,髓实则骨壮,故肾中精气的盛衰在骨骼生长发育过程中起到重要的作用。OP患者的骨代谢指标与脾肾阳虚证、肾阳虚证等中医证候密切相关[3]。传统中医理论与现代医学理论相结合,对“补肾壮骨”“补益肝肾”“调补脾肾”等中医理论指导下的中药防治OP的研究提供新的思路[4]。仙灵骨葆胶囊成分包括淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄,治疗OP疗效较好。临床试验证明,仙灵骨葆胶囊对原发性OP、绝经后女性OP等有安全且全面的作用,可有效改善L2～4、股骨颈及股骨粗隆等部位的骨密度[5-6]。本文运用网络药理学与分子对接技术,通过探究仙灵骨葆胶囊的药物成分及核心蛋白、靶点、信号通路等,进一步揭示仙灵骨葆胶囊治疗OP的机制。

1 资料与方法

1.1 药物化合物、作用靶点及靶点基因的筛选 仙灵骨葆胶囊由淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄组成。本文药物化合物通过TCMSP数据库(http://tcmsp-e.com)及TCMID数据库(http://47.100.169. 139:8000/tcmid)获取。将获得的化合物导入PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中获取其2D结构的SDF文件。将收集好的化合物SDF文件导入SwissTargetADME(http://www.swissadme.ch/)进行药物代谢动力学筛选,以胃肠道吸收率(GI absorption)为高(high),且药物类似性(Druglikeness)中Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 5个指标中“yes”的数量≥2为筛选标准。将符合筛选标准的化合物SDF文件导入SwissTargetPrediction(www. swisstargetprediction.ch)中进行靶点预测,以Probability≥0.4为筛选条件获得符合条件的靶点信息,然后将所得靶点输入Uniprot(https://www.uniprot. org)数据库,选择人类(Homo sapiens)为物种获取靶点对应的基因。经过筛选获得淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄的有效化合物、作用靶点及靶点基因,并记录该数据信息。

1.2 OP相关疾病的靶点及靶点基因的筛选 在DrugBank数据库(https://go.drugbank.com)、DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org)以“osteoporosis”为关键词进行检索,记录其靶点的名称,并将所得靶点导入Uniprot数据库,选择人类(Homo sapiens)为物种获取靶点基因。

1.3 药物靶点与OP靶点的Venn分析 将仙灵骨葆胶囊药物化合物的作用靶点与OP的疾病基因靶点导入DrawVennDiagram(bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/Venn/)进行Venn分析,得到两者共有的靶点,即为仙灵骨葆胶囊治疗OP的有效靶点。

1.4 构建蛋白质相互作用关系网络(PPI) 将上述1.3步骤中得到的交集靶点导入String数据库(https://www.string-db.org),构建PPI网络,将其结果导入Cytoscape 3.7.0进行拓扑计算,根据节点度值分布(node degreedistribution)、介度中心度(betweenness centrality)和接近中心度(closeness centrality)3个参数进行遴选,选取三者同时在中位数之上的靶点作为仙灵骨葆胶囊治疗OP的关键核心靶点,导出计算后数据进行蛋白质筛选,得到核心蛋白,并再次构建核心蛋白的PPI网络。

1.5 获取核心有效化合物 通过1.4中得到的核心靶点,筛选出核心靶点所对应的化合物为核心有效化合物,剔除与核心靶点不对应的化合物。通过对比1.1中所记录的数据信息,得到与核心靶点对应的核心有效化合物,得到其对应的核心靶点数目的排名。

1.6 GO功能富集及KEGG通路富集分析 将1.4所得到的核心靶点信息导入OmicShare Tools分析工具,选择GO功能富集及KEGG通路富集分析,得到结果图像并将其导出。

1.7 分子对接验证 选取1.5中所对应的核心靶点数目排名前4位的化合物,从TCMSP及TCMID数据库中取得化合物的分子结构,并导入PubChem中获得化合物的SDF文件,通过Open Babel3.1.1转化为mol2格式。从核心靶点PPI网络中筛选Degree值排名前3位的靶点,由PDB数据库(https://www.rcsb.org)获取化合物的3D蛋白结构的pdb格式文件,上述两者的分子结构文件使用Auto Dock Tools 1.5.6软件转换为pdbqt格式文件,利用Auto Dock 4.2.6软件进行分子对接。通过Pymol 2.4.0 软件将分子对接最稳定的化合物与基因靶点蛋白进行可视化分析。

2 结果

2.1 仙灵骨葆胶囊化合物成分的筛选 在TCMSP数据库与TCMID中获得的化合物通过SwissTargetADME筛选,共得到127种化合物成分,其中药物独有的成分如下:补骨脂27种、丹参57种、地黄5种、续断5种、淫羊藿18种、知母9种;药物共有的成分如下:丹参与淫羊藿共有2种,知母与淫羊藿共有2种,续断、淫羊藿、地黄共有1种,知母与地黄共有1种。根据127种化合物成分的SDF文件导入SwissTargetPrediction进行靶点预测,找到其对应的作用靶点蛋白并与Uniprot数据库选择人类(Homo sapiens)进行基因靶点对比,剔除重复、无效的靶点,共得到360个靶点。

2.2 疾病靶点获取结果 通过DrugBank及DisGeNET数据库中检索到与OP相关的基因靶点分别为340、1 098个,通过相关性评价得分遴选,剔除重复疾病基因靶点,共得到1 234个OP相关基因靶点。

2.3 药物与疾病靶点的Venn图建立 将2.1及2.2得到的1 234个疾病相关的基因靶点与360个有效药物的作用靶点导入DrawVennDiagram进行Venn分析,共得到仙灵骨葆胶囊潜在作用于OP的118个靶点。见图1(扫描题目右侧二维码查看)。

2.4 PPI的构建 将2.3得到的药物与疾病的交集靶点基因导入String数据库,物种设置为人类(Homo sapiens),运行后得到PPI网络,并隐藏3个未参与蛋白相互作用的靶点,共有115个靶点蛋白参与PPI网络构建。见图2(扫描题目右侧二维码查看)。

2.5 核心靶点筛选 从String数据库平台下载PPI网络文件,经Cytoscape 3.7.0软件渲染后,导出经过网络拓扑属性分析计算后的Excel文件,利用Excel函数公式筛选仙灵骨葆胶囊的核心靶点。计算后可知115个靶点度值中位数为28,介度中心度的中位数为2.569×10-3,接近中心度的中位数约为0.558。经过筛选,3个数值在中位数以上的靶点共有47个,度值较高的前6位分别为TP53(83)、TNF(83)、AKT1(80)、IL6(79)、HIF1A(72),JUN(72),这些靶点在PPI网络中处于关键位置,可能在仙灵骨葆胶囊治疗OP的过程中起到关键作用,将此47个靶点同上操作,导入String数据平台构建PPI网络,见图3(扫描题目右侧二维码查看)。在2.1记录的信息文件中寻找将47个核心靶点及所映射的化合物及中药数据,通过数据对比得到与核心靶点对应的化合物。其中对应靶点数目排名前4位的是木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)和脱水淫羊藿素(anhydroicaritin),这4种化合物对应的靶点数目从高到低依次是26、24、14、6。

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 将仙灵骨葆胶囊治疗OP的47个核心靶点导入g:Profiler(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost),将靶点基因ID转化为ENSG ID,然后将转换好ID的靶点导入OmicShare Tools进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,经过校正P值,P<0.05后,得到10个分子功能类别,其中包括核受体活性(nuclear receptor activity)、双链DNA结合(double-stranded DNAbinding)等;得到10个生物学过程,其中包括对含氧化物的反应(responseto oxygen-containing compound)、对细胞因子的反应(response to cytokine)、细胞增殖调控(regulationof cell proliferation)等;得到10个细胞成分,其中包括膜筏(membrane raft)、转录因子复合物(transcription factor complex)等。P值越小代表富集程度越高,遴选出每个类别富集程度最高的10个结果,使用OmicShare Tools工具建立气泡图,见图4-1、4-2、4-3(扫描题目右侧二维码查看)。KEGG通路富集分析得到127条信号通路,其中根据阈值P<0.01进行筛选,取排名前20位的通路,包括肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)等,建立气泡图,见图5(扫描题目右侧二维码查看)。

2.7 药物化合物与核心靶点的分子对接 核心靶点数目排名前4位的化合物是木犀草素、山柰酚、槲皮素和脱水淫羊藿素,核心靶点PPI网络中度值前3位的靶点分别是TP53、TNF、AKT1,见表1。核心靶点的蛋白运用PDB数据库(https://www1.rcsb.org/)获得PDB文件,Pymol 2.4.0 软件打开,进行脱水等一系列处理;化合物从TCMSP与TCMID数据库中找到对应的PubChem ID,并导入PubChem数据库获得SDF文件,使用Open Babel 3.1.1软件将文件从SDF格式转化为mol2格式,并用 Auto Dock 4.2.6 软件打开处理后的化合物及蛋白质文件,并进行进一步处理,处理完成后将化合物与蛋白质两两进行分子对接处理。就分子对接而言,结合能(bindingenergy,kcal/mol)越小,表明化合物与蛋白质之间结合得越牢固,其数值小于-4.25 kcal/mol时,表示化合物与蛋白质之间有一定结合活性。由表1可知,所有对接能都小于-4.25 kcal/mol,说明化合物与靶蛋白之间均有结合活性[7]。通过Pymol 2.4.0 软件对上述化合物与蛋白质进行分子对接可视化分析,见图6-1～图6-12(扫描题目右侧二维码查看)。通过分子对接发现,脱水淫羊藿素与活性位点附近的GLU-40、LYS-39、LEU-52这3个氨基酸形成氢键结合到AKT1,与活性位点附近的ALA-134、ILE-136、ASN-46这3个氨基酸形成氢键结合到TNF,与活性位点附近的LSY-132、GLU-271、ARG-248、GLN-165这4个氨基酸形成氢键结合到TP53。山柰酚与活性位点附近的GLN-47、GLU-40、LYS-39这3个氨基酸形成氢键结合到AKT1,与活性位点附近的TRP-28、ASN-46、ALA-134、ILE-136这4个氨基酸形成氢键结合到TNF,与活性位点附近的GLN-144、CYS-229、GLU-224、PRO-222、GLU-198这5个氨基酸形成氢键结合到TP53。木犀草素与活性位点附近的LEU-78、GLN-61、ARG-76这3个氨基酸形成氢键结合到AKT1,与活性位点附近的ASN-34、PHE-144、GLN-149、VAL-150这4个氨基酸形成氢键结合到TNF,与活性位点附近的GLU-285、ARG-248、GLN-165、LYS-132这4个氨基酸形成氢键结合到TP53。槲皮素与活性位点附近的LYS-8、GLU-98、GLU-9这3个氨基酸形成氢键结合到AKT1,与活性位点附近的ALA-33、PHE-144、GLN-149、VAL-150这4个氨基酸形成氢键结合到TNF,与活性位点附近的ARG-248、LYS-132、GLU-285、ARG-273、GLN-165这5个氨基酸形成氢键结合到TP53。

表1 仙灵骨葆胶囊药物化合物与核心靶点的分子对接表(kcal/mol)

3 讨论

本研究结果显示,仙灵骨葆胶囊发挥疗效的主要化合物包括木犀草素、山柰酚、槲皮素和脱水淫羊藿素等。研究表明,RA NLRP3炎性小体过表达可被木犀草素潜在抑制,且后者可降低血管内皮生长因子(VEGF)等蛋白的表达,增强骨保护素(OPG)蛋白表达,进而对骨关节起到保护作用[8]。木犀草素可有效减轻氧化损伤,其作用机制可能与潜在保护MC3T3-E1类成骨细胞氧化应激反应有关[9]。骨丢失过程可被糖皮质激素诱导,山柰酚可以通过保护成骨细胞存活以抑制此过程的发生[10]。槲皮素能通过增加骨小梁的结构和数量、增加骨密度以预防及治疗失用性OP,其作用途径可能与抑制ERK1/2、MAPK mRNA和蛋白的表达,进而抑制ERK1/2-MAPK信号通路有关[11]。此外,有实验证明,槲皮素可通过升高BMP2和Smad4的表达水平,进而促进成骨细胞分化以缓解OP[12]。脱水淫羊藿素具有抗氧化活性的作用,研究表明,1×10-5mol-1浓度的脱水淫羊藿素能提高成骨细胞中碱性磷酸酶的活性,增强成骨细胞的生理功能,可以提高BMP-2、OSX和Runx-2等与成骨细胞成熟矿化相关因子的mRNA表达,进而增加能促进骨基质矿化的钙盐[13-14]。综上所述,仙灵骨葆胶囊中一些潜在分子活性成分通过抑制破骨细胞的生成、促进骨细胞成熟矿化作用等对OP起到预防及治疗的作用。

然而当前利用网络药理学方法研究中药、中药方剂的作用机制尚存在诸多不足。网络药理学基于现代生物药剂学分类系统,适用于单一化学成分的预测,但不适合中药复杂系统的研究,中药不同于化学成分单一的化学药,中药方剂更不是化学成分的简单加和[15]。在筛选所谓有效成分的参数设置中,除口服生物利用度(OB)和/或类药性(DL)外,其他诸多性质也会影响药物活性,在确定有效成分时需全面考虑这些影响因素,而网络数据库基于吸收、分布、代谢、排泄(ADME)等数据处理方式的筛选,忽略了成分含量对药效的影响,忽略了中药成分间的相互作用,包括相互调节体内吸收和体内过程等作用,忽略了药物成分可能通过调节肠道菌群而发挥间接治疗作用,尤其体现于忽略了滋补类中药的多糖类成分的菌群调节作用等。基于以上不足,导致网络药理学推测出的所谓活性成分与基础研究已经证实的重要活性成分有很大出入,导致所得结果与真实情况不符。仙灵骨葆胶囊由淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄组成。研究表明,0．10 μmol/L浓度的异补骨脂素可有效促进成骨细胞的增殖分化[16];中药地黄中梓醇、桃叶珊瑚苷、毛蕊花糖苷可增强成骨细胞中碱性磷酸酶活性,在一定程度上可加速破骨细胞的凋亡[17];淫羊藿的活性成分淫羊藿总黄酮可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,提高骨修复,促进骨形成[18]。此外,大鼠体外细胞实验研究表明,续断皂苷可促进骨钙素升高,提高成骨细胞碱性磷酸酶活性[19];知母皂苷元能促进骨形成,抑制骨吸收,调节骨代谢[20];丹参素可以增加成骨细胞分化相关基因、碱性磷酸酶及骨钙素的表达,阻止OP的发生[21]。以上药物化合物都已经被证实对OP的防治有明显的作用。本文通过网络药理学推测出的有效成分主要是一些黄酮类成分,如槲皮素、山柰酚、木犀草素等,与已经研究证实的药物化合物相差甚远。由此而见,依托于网络药理学技术手段进行药物的理论分析仍存在较大的局限性,更加精确的药物作用机制还需进一步实验证明。