地龙药材及其处方制剂散寒化湿颗粒中总砷及砷形态研究

王书娟，胡军华 ，姚 雪 ，汪盛华 ，周恩丽 ，章晨峰 ，于桂芳 *，王振中, *

1.南京中医药大学，江苏 南京 210023

2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001

3.中药制药过程控制与智能制造技术全国重点实验室，江苏 连云港 222001

砷（As）元素属于类金属元素，其化合物的种类在自然界中繁多，不同种类的砷化合物具有不同的形态、价态[1-2]。目前，常见的砷化合物主要有亚砷酸［arsenious acid，As(III)］、砷酸［arsenic acid，As(Ⅴ)］、一甲基砷（monomethylarsenic，MMA）、二甲基砷（dimethylarsenic，DMA）、砷甜菜碱（arsenobetaine，AsB）、砷胆碱（arsenocholine，AsC）6 种[3-4]。毒理学研究表明，不同形态、价态的砷化合物的毒性不同。通常无机砷（inorganic arsenic，iAs）有剧毒，其中As(Ⅲ)的毒性是As(Ⅴ)的60 倍，有机砷（MMA 和DMA）的毒性中等，而AsB 和AsC 则被认为是无毒的[5-7]。目前，常见的砷形态分析的方法主要有高效液相色谱-原子荧光联用技术（HPLC-AFS）、高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光度法（HPLC-HG-AFS）、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）等[8-12]。与其他分析方法相比，利用HPLC-ICP-MS 技术进行砷化合物的分析，能够避免光谱和基底的干扰，灵敏度高、专属性、精密度较好，分析速度快，操作简便，具有明显的优势[13-15]。

散寒化湿颗粒（Sanhan Huashi Granules，SHG）是由江苏康缘药业股份有限公司根据《中药注册分类及申报资料要求》中3.2 类注册要求和疫情期间临床上实际使用药物的生产工艺所研发上市的颗粒剂[16]。该方主要由麻黄、厚朴、煨草果、地龙等20味中药组成，具有散寒化湿、祛毒通络、宣肺透邪等功效，其临床疗效显著，安全性良好[17-18]。该处方药味中地龙为常用的动物药，在中药复方中具有不可替代的作用[19]，但其重金属及有害元素含量超标的问题时有发生，特别是砷元素超标的情况[20-23]，其临床使用的安全性问题一直是备受关注，也在一定程度上对地龙药材及其复方制剂的应用和推广造成影响。截至目前，关于SHG 中总砷和砷形态的含量及其限度的制定等研究尚未见相关报道。本研究通过采用ICP-MS 对地龙药材、饮片、地龙饮片提取液、SHG 中的总砷含量进行测定分析，再采用HPLC-ICP-MS 对其中6 种不同形态、价态的砷含量进行测定，探究其传递规律；同时对多批次SHG 制剂及不同产地的地龙药材进行分析，以期初步建立地龙药材的内控标准，从源头上控制药材质量，确保SHG 的安全性，同时为地龙药材的评价积累数据，也为其他含有地龙药味的中药复方制剂的风险防控提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Flexar 型高效液相色谱仪、NexION 300X 型电感耦合等离子体质谱仪，美国Perkin Elmer 公司；ETHOS UP 型微波消解仪，北京安南科技有限公司；Mettler Toledo AL204 型电子分析天平，德国梅特勒公司；Milli-Q Academic 型超纯水仪，美国密理博公司；HH-6 型数显恒温水浴锅，金坛市康华电子仪器制造厂；VB24 UP 型赶酸器，北京莱伯泰科有限公司；TDL-5-A 型低速大容量离心机，上海安亭科学仪器；KDM 型电热套，山东鄄城华鲁电热仪器有限公司；实验所用玻璃仪器均用20%硝酸溶液浸泡24 h 以上，并用超纯水冲洗干净，晾干备用。

1.2 材料

1.2.1 试剂 胃蛋白酶（批号220909）、碳酸铵（批号20200326）、无水乙醇（批号20220803）均购自于国药集团化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠（批号11071120645）、磷酸氢二铵（批号11072920722）均购自于南京化学试剂有限公司；硝酸UP 级（电子级硝酸，金属杂质含量小于10 ng/L），苏州晶瑞化学试剂有限公司；水为超纯水；硝酸人工胃液（按照《中国药典》2020 年版四部通则2322 配制）；GraphPad Prism 软件，Version 8.0，美国GraphPad Software 公司；SIMCA 软件，Version 14.1，瑞典MKS Umetrics 公司。

1.2.2 标准物质 Au 单元素标准溶液（1.000 mg/mL，批号GSB04-1715-2004）、As 单元素标准溶液（1.000 mg/mL，批号GSB04-1714-2004），Ge单元素标准溶液（1.000 mg/mL，批号GSB04-1728-2004）均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；亚砷酸根溶液标准物质［批号GBW0866，质量分数以砷（As）计为（75.7±1.2）μg/g］、砷酸根溶液标准物质［批号GBW0866，质量分数为（17.5±0.4）μg/g］、一甲基砷溶液标准物质［批号GBW08668，质量分数以砷（As）计为（25.1±0.8）μg/g］、二甲基砷溶液标准物质［批号GBW08669，质量分数以砷（As）计为（52.9±1.8）μg/g］、砷甜菜碱溶液标准物质［批号GBW08670，质量分数以砷（As）计为（38.8±0.1）μg/g］、砷胆碱溶液标准物质［批号GBW08671，质量分数以砷（As）计为（28.0±1.1）μg/g］均购自于中国计量科学研究院；调谐液（含Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U，质量浓度均为1 µg/L，Lot38-31GSX1）购自美国Perkin Elmer 公司。

1.2.3 样品

（1）传递规律研究用样品。对应关系1：地龙药材（批号Y2101023）、地龙饮片（批号YP2104025）、缺地龙SHG 阴性样品（SHG-阴性）、SHG（批号210401、210402、210403）。对应关系2：地龙饮片（批号YP2211066）、缺地龙SHG 阴性样品（SHG-阴性）、SHG（批号221203）。地龙样品分别来自于广东、广西，均为钜蚓科环毛蚓属动物参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)。

（2）多批次SHG。共28 批，批号分别为210401、210402、210403、221202、221203、221204、221205、221206、221207、221208、221209、221210、221211、221212、221213、221215、221216、221217、221233、221234、221235、221236、221237、221238、221240、221241、221242、221243，编号分别为SHG1～SHG28，均购自江苏康缘药业股份有限公司。

（3）多批次地龙药材。共24 批，均购自于中药材市场，均经南京中医药大学中药资源学教研室（中药资源与栽培技术中心）主任谷巍教授鉴定，结果分别为钜蚓科环毛蚓属动物参环毛蚓P.aspergillum(E.Perrier)、通俗环毛蚓P.vulgarisChen、威廉环毛蚓P.guillelmi(Michaelsen)的干燥体，习称“广地龙”或“沪地龙”，具体信息见表1。

表1 地龙药材至制剂的总砷及砷形态测定结果Table 1 Determination results of total arsenic and arsenic speciation from Pheretima herbs to preparations

表1 地龙样品信息Table 1 Information of Pheretima samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 ICP-MS 条件 总砷测定时采用碰撞反应池模式，等离子气体流量16.0 L/min，雾化器流量0.94 L/min，辅助气流量1.2 L/min，射频功率1 600 W，脉冲阶段电压1 300 V，模拟阶段电压−2 200 V，蠕动泵的转速为20 r/min，载气为高纯液氩，跳峰采集模式，测定时选取74Ge 为内标；砷形态测定时，ICP-MS 与HPLC 通过数据线连接传递信号，ICPMS 采集模式为时间分辨模式（time resolved mode，TRA），检测质量数m/z为75（As），其他采集条件同总砷测定模式。

2.1.2 HPLC 条件 Hamilton PRP-X100（150 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相为1.5 mmol/L 磷酸氢二铵溶液（A）-100 mmol/L 碳酸铵溶液（B）；柱温为30 ℃；体积流量为1.0 mL/min；进样体积为20 μL；梯度洗脱：0～2 min，10%～12% B；2～4 min，12%～100% B；4～9 min，100% B～10% B；9～10 min，10% B。在选定的条件下，6 种砷形态、价态的色谱图、SHG、地龙药材及SHG 地龙阴性典型样品图见图1。

图1 砷元素形态测定图谱和典型样品图Fig.1 Determination of arsenic form and typical sample

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 总砷测定标准溶液 精密吸取As 单元素标准溶液适量，用5%硝酸稀释，制成含砷为10 μg/mL的标准储备液。精密量取该储备液适量，用5%硝酸稀释制成含砷元素分别为5、20、50、100、200、250 ng/mL 的系列标准溶液。

2.2.2 形态砷测定标准溶液 分别精密称取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsC、AsB 对照品适量，加0.02 mol/L 乙二胺四醋酸二钠溶液制成各含2.0 μg/mL（以As 计）的混合对照品储备液。分别精密吸取对照品储备液适量，加入0.02 mol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液制成各含1、5、20、50、100、200 ng/mL 的系列标准曲线混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 提取浸膏的制备 精密称取混合均匀的地龙饮片（过三号筛，批号YP2104025、YP2211066）约4 g，精密加入水50 mL，加热回流提取2 h，浓缩成浸膏（密度1.10 g/cm3），待用。

2.3.2 总砷测定供试品溶液 精密称取混合均匀的样品（过三号筛）约0.5 g 于聚四氟乙烯消解罐中，加入硝酸10 mL，混匀，待气泡散尽，置预先设置好参数的微波消解仪中（消解功率为1 500 W，在20 min 内升温至190 ℃，消解40 min），消解完全后放置室温，取出，待蒸气散尽后，将消解液转移至50 mL 聚丙烯量瓶中，用水洗涤消解罐2～3 次，洗液与消解液合并，加水定容至刻度线，摇匀即可。如果测定提取浸膏中的总砷，则精密称取提取浸膏适量于聚四氟乙烯消解罐中，自“加入硝酸10 mL”起，保持相同操作。同法制备试剂空白溶液。

2.3.3 形态砷测定供试品溶液 精密称取混合均匀的样品（过3 号筛）约0.2 g 于50 mL 离心管中，精密加入硝酸人工胃液10 mL，40 ℃水浴震荡8 h，待冷却至室温后，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。如果测定提取浸膏中的砷形态，则精密称取提取浸膏适量于50 mL 离心管中，自“加入硝酸人工胃液10 mL”起，保持相同操作。同法制备空白溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围考察 采用HPLC-ICP-MS，分别精密吸取配制好的6 种砷形态化合物质量浓度为1、5、20、50、100、200 ng/mL 的溶液各20 μL 进样，以质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数，结果分别为AsCY＝3 137.229 9X，r＝0.999 9，线性范围1～200 ng/mL；AsBY＝3 823.738 9X，r＝0.999 9，线性范围1～200 ng/mL；As(III)Y＝2 841.969 3X，r＝0.999 9，线性范围1～200 ng/mL；DMAY＝4 077.541 7X，r＝0.999 9，线性范围1～200 ng/mL；MMAY＝4 054.937 0X，r＝0.999 9，线性范围1～200 ng/mL；As(V)Y＝4 217.265 7X，r＝0.999 9，线性范围1～200 ng/mL。结果显示，各成分在1～200 ng/mL 线性关系良好。

2.4.2 精密度试验 精密称取地龙样品1 份（S15），按“2.3.2”项下方法平行制备供试品溶液，连续进样6 次，计算AsB、As(III)、MMA、As(Ⅴ)峰面积的RSD 分别为2.11%、0.87%、2.37%、1.62%，符合微量元素分析的要求，表明仪器进样精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 精密称取地龙样品1 份（S15），按“2.3.2”项下方法平行制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h 进样测定，计算得到AsB、As(III)、MMA、As(Ⅴ)峰面积的RSD 分别为3.81%、5.68%、6.82%、3.26%，符合微量元素分析的要求，表明供试品溶液在8 h 内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 精密称取地龙样品的供试品溶液（S15）6 份，按“2.3.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，分别进样20 μL，计算得到AsB、As(III)、MMA、As(Ⅴ)质量分数的均值分别为0.22、1.60、1.24 μg/g，RSD 分别为6.06%、5.79%、13.96%、7.06%，符合微量元素分析的要求，表明重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取适量重复性试验样品（S15）6 份置50 mL 离心管中，分别加入混合对照品溶液（1 μg/mL）1 mL，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样20 μL，测定并计算加样回收率。结果表明，AsC、AsB、As(III)、DMA、MMA、As(Ⅴ)的平均加样回收率分别为111.61%、103.78%、96.08%、94.15%、94.77%、79.20%，其RSD 分别为5.4%、6.9%、7.2%、8.0%、6.9%、7.8%，符合微量元素分析的要求，说明该方法准确性良好。

2.5 样品测定结果

2.5.1 传递规律研究 通过对研究传递规律批的地龙药材、地龙饮片、饮片提取液、SHG 中的样品进行处理。采用ICP-MS 对上述样品进行总砷含量的测定，并采用HPLC-ICP-MS 对其进行相应的砷形态及价态分析，测定结果见表1。由结果可以看出，地龙药材、饮片、提取液及SHG 在传递过程中总砷含量呈递减趋势，其中，总砷在对应关系1 中各物料的转移率（即药材→饮片→提取液→SHG）分别为85.58%、78.95%、76.97%；基于制剂处方，药材到制剂中的平均转移率为52.00%，饮片到制剂中的平均转移率为60.81%；总砷在对应关系2 中各物料的转移率（即饮片→提取液→SHG）分别为76.11%、80.60%，饮片到制剂中的转移率为64.79%。SHG 阴性样品中检出极少量的砷，且采用同一批地龙制备的3 批制剂中6 种砷形态含量以及总砷含量相近，可推测SHG 中的砷几乎均来自地龙药材，地龙对SHG 的砷含量起决定性作用。

2.5.2 地龙药材与SHG 的多批次测定 采用“2.3”项下方法，对市售地龙药材及多批次的SHG 进行测定，测定结果见表2、3。结果显示，24 批次地龙药材中总砷含量在3.96～24.55 mg/kg，平均值为12.31 mg/kg，反映出不同产地的地龙药材中总砷含量差异较大，且均高于《中国药典》2020 年版植物类“重金属及有害元素一致性限量”指导值（砷不得过2 mg/kg）[4]，游离的无机砷（inorganic arsenic，iAs）含量较高，占总砷含量的90%以上，且其形态与总砷含量之间并非呈现简单的正相关，因此有必要对多批次地龙作进一步的分析，探究不同产地对地龙中砷含量的影响，以便更加方便直观对其进行评价，从源头上保障制剂的安全性。28 批SHG 中的总砷含量在0.84～2.21 mg/kg，平均值为1.60 mg/kg，游离的iAs 占检出总量的89.2%～97.2%，其中As(III)最高检出量为1.61 mg/kg，As(Ⅴ)最高为0.68 mg/kg，iAs 总量平均值为0.55 mg/kg，检出少量的AsC、AsB、MMA，而DMA 大多未检出。

表2 地龙中总砷和砷形态测定结果Table 2 Determination results of total As and arsenic speciation in Pheretima

表3 SHG 中总砷和砷形态测定结果Table 3 Determination results of total As and arsenic speciation in SHG

聚类分析（hierarchical clustering analysis，HCA）是用于中药化学成分与物料性质等归类的一种常用方法[24-26]。为进一步阐明地龙药材中无机砷的分布特征，采用SIMCA 软件对24 批地龙药材中总砷与5 种主要砷形态、价态含量进行聚类分析（DMA 均未检出）。结果（图2）显示，S7 与S8 聚为一类；S22～S24 聚为一类；S5～S6、S14～S16 与S19 聚为一类；S1～S4、S9～S13、S17～S18 与S20～S21聚为一类。结果显示，除来自湖北的3 批药材聚为一类外，其他产地地龙药材中总砷形态化合物存在一定的交互现象，说明地龙药材中普遍存在这5 种砷化合物，其在质量传递过程中的变化影响可做进一步分析。

图2 多批次地龙药材总砷与砷形态聚类分析Fig.2 Cluster analysis of total arsenic and arsenic form in many batches of Pheretima herbs

主成分分析法（principal component analysis，PCA）是基于数学降维思路对原来变量重新组合成几个能反映多数变量信息、对复杂因子下的变量进行简单化的统计方法[27-28]，也是药材质量评价的主要手段之一。研究中采用SIMCA 软件，对24 批地龙药材中5 种主要砷化合物含量，进行主成分信息提取分析。由提取到的信息（表4）可知，主成分1（PC1）与主成分2（PC2）方差贡献率分别为45.98%、25.89%，累积贡献率达71.87%，可以解释大部分变量对模型的影响。为进一步分析各形态元素间的相互关系，对构成PC1 与PC2 的5 种化合物形态做相关性分析。

表4 PCA 数学模型的提取信息Table 4 Extraction information of PCA mathematical model

由GraphPad Prism 软件绘制得到的二维矩阵热点图（图3）结果可知，As(Ⅲ)与MMA、As(Ⅴ)呈显著相关（P＜0.05）；MMA 与As(Ⅴ)呈显著相关（P＜0.05）。可以发现，As(III)、MMA 与As(Ⅴ) 3 种形态化合物间相互关联性较强，同时As(Ⅴ)受其他2 种化合物影响，反映出As(Ⅴ)是地龙药材重金属中起主要影响作用的砷化合物，也是质量控制过程中需重点关注的检测指标。

图3 多批次地龙药材中5 种砷元素间二维矩阵热点图Fig.3 Two-dimensional matrix hot spot map of five arsenic elements in multiple batches of Pheretima herbs

3 讨论

3.1 供试品制备方法优化

砷形态化合物的提取应该在不使原有形态发生改变和互相转化的前提下进行。目前砷形态化合物的提取方法种类繁多，如水提取、稀硝酸提取、酶解析提取、乙酸提取等[29]。本实验选用硝酸人工胃液提取，通过仿生手段模拟胃肠环境，以期得到的成分更接近人体真实情况；同时参考《中国药典》2020 年版四部通则2322 中汞、砷元素形态及价态中供试品溶液的制备方法[4]，在此基础上对供试品处理条件进行优化，考察了水浴加热与水浴震荡2种提取方式，并对提取时间、静置时间进行筛选，通过比较6 种不同砷形态、价态的化合物的含量及总量。结果表明，选择水浴加热时，20 h 提取的效果更充分；提取方式为水浴震荡时，8 h 提取的较为充分；同时比较水浴加热20 h 与水浴震荡8 h 的提取效果，发现两者效果相当；是否需静置2 h 的结果显示影响较小。综上，在达到相同的提取效果的前提下，选择硝酸人工胃液为溶剂，水浴震荡8 h 后直接离心能够有效缩短提取时间，故采用该优化后的方法。

3.2 色谱条件的选择

基于美国Perkin Elmer 公司液相仪器的碳酸盐体系特性，选用Hamilton，PRP-X100 阴离子交换色谱柱；与0.025 mmol/L 的磷酸二氢铵（氨水调节pH值至8.0）-水对比，1.5 mmol/L 磷酸氢二铵溶液-100 mmol/L 碳酸铵溶液作为流动相，不需调节pH 值，操作较为方便，色谱图基线噪音较小，基线较为平稳；且碳酸铵系统进入ICP-MS 后，被分解成易挥发的气体，能够有效减少盐的残留，减轻对采样锥的污染，进而选择1.5 mmol/L 磷酸氢二铵溶液和100 mmol/L 碳酸铵溶液作为流动相。

3.3 建立地龙药材与SHG 的内控标准

《中国药典》2020 年版一部中地龙重金属检查项下，规定用通则0821 第二法检查，含重金属不得过30 mg/kg。该法是通过供试品溶液与硫代乙酰胺作用显色，再与一定量的标准铅溶液同样处理后的颜色进行比较[30]。此法是一种半定量分析方法，仅凭肉眼判断重金属的含量是否超标，准确度有限，更无法分析其中含有的化合物形态。因此，有必要采用更精确的检测方法对地龙以及复方制剂中的砷总量及价态进行研究，以确保用药安全与药品的质量可控。根据本课题组积累的多批次地龙药材重金属含量测定结果与相关文献报道[20-23]，对结果进行统计分析发现市售地龙总砷含量普遍偏高。考虑地龙市场供应的实际情况以及动物药疗效的不可替代性等因素，同时参考临床批制剂所用地龙药材中总砷的含量情况（11.78 mg/kg），暂拟定地龙药材中As的限度为15.00 mg/kg。结合量-值传递规律及制剂处方，得出SHG 中总砷的限度为2.25 mg/kg，换算公式如下：SHG 中的总砷含量＝地龙药材中砷转移的量＋SHG 阴性样品砷含量＝15.00 mg/kg×250 g×52.00%/1.000 kg＋0.30 mg/kg＝2.25 mg/kg（250 g 为SHG 中地龙药材在制剂中的处方量，1.000 kg为SHG工艺生产时最后的制得量）。

因此，暂拟定SHG 中总砷的限度为2.50 mg/kg，又因药材及制剂中均以毒性较大的无机砷为主，所以暂不拟定砷形态及价态限度。

4 结语

本实验基于HPLC-ICP-MS 法首次对地龙药材及SHG 中的总砷及砷形态进行分析研究，反映了地龙药材到SHG 制剂中的量-值传递规律，并对其中的地龙药材及SHG 制定初步的总砷含量限度，以期科学评价地龙药材及SHG 的安全性。鉴于目前课题进展与后续实验安排，该总砷含量值只是目前暂定的参考值，后期还将对其进行蓄积性研究，分析其吸收排泄规律，以期建立更加准确的地龙药材总砷的安全值，为SHG 的安全性提供保障；同时建议尽快建立地龙等动物药及相关制剂中高毒形态与高含量（如iAs）的重金属形态限量标准，以期保障动物药及相关制剂的安全性，进而促进中药的可持续发展。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突