酶法制备野黄芩素的工艺研究

程雨婕，刘云华，黄志芳，陈燕，刘玉红，易进海（1. 成都中医药大学药学院，四川成都 611130；. 四川省中医药科学院中药材品质及创新中药研究四川省重点实验室，四川成都 610041）

野黄芩素为4’，5，6，7-四羟基黄酮，其7-O-β-葡萄糖醛酸苷为野黄芩苷。野黄芩苷具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、改善心脑缺血、神经保护等多种药理作用[1-4]，但其口服生物利用度低、体内半衰期短[5-7]。而野黄芩素具有更强的生物活性、口服易于吸收[4，8]，与野黄芩苷相比，其相对生物利用度为301.8%[9]，具有更好的药用价值。野黄芩素在植物中的含有量很低，难以从相关植物中大量提取。目前野黄芩素主要采用化学合成[10-12]和酸水解[13-14]等方法制备，但多存在使用有毒溶剂、副产物多、高温、操作复杂、成本高等缺点，因此亟需寻找新的野黄芩素制备途径。相较于野黄芩素，野黄芩苷的来源较为丰富，广泛分布于唇形科黄芩属和菊科飞蓬属植物中，因此，可从含有量相对较高的植物如灯盏细辛（灯盏花）中获取野黄芩苷，再通过生物转化的方法获得野黄芩素[15]。黄芩茎叶葡萄糖醛酸水解酶（Scutellaria baicalensis stems and leaves glucuronic hydrolase，sbslGUS）是一类能够水解β-葡萄糖醛酸苷键的酶，本课题组前期已对sbslGUS 进行了提取工艺研究，并利用sbslGUS 酶解黄芩苷制备黄芩素。本研究提取灯盏花中的野黄芩苷，应用sbslGUS 酶解野黄芩苷转化为野黄芩素，经分离纯化获得高纯度的野黄芩素提取物，可为野黄芩素化合物的制备提供新的途径。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent1260 型高效液相色谱仪系列（美国Agilent 公司）；KQ-300E 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；SQP型十万分之一电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；Milli-Q Integral 3 型超纯水机（美国Millipore 公司）；IKA C-MAG HS7 型加热磁力搅拌器（德国IKA 公司）；Sorvall Lynx 4000型高速离心机（美国赛默飞世尔科技公司）；DZKW-4型电热恒温水浴锅（北京中兴伟业世纪仪器有限公司）；R-3型旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）；ZKF035型电热真空干燥箱（上海实验仪器厂有限公司）。

1.2 材料 黄芩茎叶采自陕西澄城，经四川省中医药科学院李青苗研究员鉴定，为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的茎叶。灯盏花购自云南泽生生物科技有限公司，经四川省中医药科学院李青苗研究员鉴定，为菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz.的干燥全草。野黄芩苷对照品（纯度≥98%，批号：DST191012-026），野黄芩素对照品（纯度≥98%，批号：DST191221-030），成都德思特生物技术有限公司；甲醇（色谱纯，美国Fisher 公司）；甲酸（色谱纯，成都市科隆化学品有限公司）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 测定方法

2.1.1 高效液相色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～12 min，40% B；12～30 min，40%～55% B）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：278 nm；进样量：5～10 μL。理论塔板数按野黄芩素峰计算应不低于3 000。色谱图见图1。

2.1.2 对照品储备液的制备 取野黄芩苷对照品、野黄芩素对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1 mL 含野黄芩苷163.2 μg、野黄芩素181.0 μg 的混合对照品储备液。

2.1.3 供试品溶液的制备 灯盏花水煎液供试品的制备：取灯盏花切段，加水煎煮，滤过，得灯盏花水煎液。取灯盏花水煎液适量，置10 mL量瓶，加70%乙醇至刻度，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

酶解产物供试品的制备：取黄芩茎叶（粉碎过40 目筛），加10 倍水（第1 次多加4 倍）室温搅拌提取3 次，每次15 min，过滤，合并滤液，得sbslGUS 提取液；sbslGUS 提取液与灯盏花水煎液于一定温度水浴酶解，加入3倍酶解体系量乙醇终止反应，转移至量瓶中，超声处理（300 W，40 kHz）20 min，放置至室温，加70%乙醇至刻度，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.1.4 标准曲线的绘制 分别精密移取混合对照品储备液0.5、1、2、4、5、10 mL至10 mL量瓶，加70%甲醇至刻度，摇匀，按“2.1.1”项下方法测定。以溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1。结果表明野黄芩苷、野黄芩素分别在8.16～163.2、9.05～181 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系。

表1 野黄芩苷和野黄芩素的标准曲线回归方程、相关系数与线性范围Table 1 Regression equations，correlation coefficients and linear ranges of scutellarin and scutellarein

2.1.5 精密度试验 取一定浓度的混合对照品溶液，照“2.1.1”项下色谱条件，重复进样6次，计算峰面积的RSD。结果显示，野黄芩苷、野黄芩素的RSD分别为0.16%、0.05%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 配制供试品溶液，室温放置，照“2.1.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样。野黄芩苷、野黄芩素峰面积的RSD分别为0.89%、0.62%，表明供试品溶液室温放置24 h内稳定。

2.1.7 重复性试验 按供试品溶液制备方法平行制备6 份供试品溶液，照“2.1.1”项下色谱条件依次平行测定，计算得野黄芩苷、野黄芩素质量浓度的RSD分别为2.35%、1.33%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收试验 精密量取已知含量的供试品溶液6 份，加入适量混合对照品储备液，混匀，照“2.1.1”项下色谱条件进行含量测定，计算得野黄芩苷、野黄芩素的平均回收率分别为100.88%、100.11%，RSD 分别为1.05%、0.73%，表明该方法回收率良好。

2.2 灯盏花提取工艺研究

2.2.1 吸水率试验 称取灯盏花（切段）100 g，加水10 倍，回流提取（煮沸）1 h后，浸泡过夜，滤除未被吸收的水液，计算吸水率约为479%。故后续实验中首次煎煮时多加5倍水补足药材吸水量。

2.2.2 煎煮条件筛选[16]煎煮次数、加水量、煎煮时间为影响提取的主要因素，采用4 因素3 水平进行正交试验研究，优选最佳煎煮条件。以野黄芩苷为评价指标，采用正交试验对煎煮次数（A）、加水量（B）、煎煮时间（C）进行优选。称取灯盏花100 g（切段），共9 份，按L9（34）正交试验设计方案安排试验（见表2和表3），加水煎煮（第1 次多加5 倍），滤过，合并滤液，测量体积。取水煎液照供试品溶液的制备方法处理，即得1～9 号供试品溶液，照“2.1.1”项下色谱条件测定，计算水煎液中野黄芩苷总量。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal design

表3 正交试验设计及结果Table 3 Design and results of orthogonal test

由表3 可知，C 因素极差小于空白列，故将C 因素与空白列合并计算误差。方差分析结果见表4。

表4 方差分析结果Table 4 Results of variance analysis

方差分析结果显示，煎煮次数（A）有显著性差异，加水量（B）无显著性差异。由表3 正交试验结果可知，各因素作用主次为A＞B＞C，最佳方案为A3B3C3，但三因素2、3水平间差异均不大，从节约能耗、降低成本、提高生产效率等考虑，选择次佳水平，拟定灯盏花煎煮条件为A2B2C2。

2.2.3 验证实验 称取灯盏花（切段）100 g，按照拟定方案A2B2C2和最佳方案A3B3C3进行验证实验，重复3 次。结果见表5。由表5可知，拟定方案A2B2C2相较于最佳方案野黄芩苷提取率略有降低，但加水量、煎煮时间和次数均减少，应为最优方案。综上，确定灯盏花提取工艺为：灯盏花切段，加10 倍水（第1 次多加5 倍）提取2 次，每次1 h，滤过，合并滤液，得灯盏花水煎液。

表5 验证实验结果（n=3）Table 5 Results of verification test（n=3）

2.3 酶解条件研究[17-18]以野黄芩苷酶解转化率为评价指标，对影响酶解效果的主要因素抗氧化剂、酶用量、酶解pH 值、温度、反应时间等酶解条件进行考察。

野黄芩苷酶解转化率＝m2×M1/（m1×M2）。m1为野黄芩苷质量，m2为野黄芩素的实际测得量，M1为野黄芩苷的相对分子质量，M2为野黄芩素的相对分子质量。

2.3.1 抗氧化剂对转化率的影响 取sbslGUS 提取液1.5 mL、灯盏花水煎液10 mL，分别加入1%亚硫酸钠、1%亚硫酸氢钠、1%偏重亚硫酸钠，另设不加抗氧化剂对照（以灯盏花质量计，下同），于45 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”项下方法测定各酶解样品中野黄芩素含量，并计算转化率，结果分别为78.0%、81.4%、83.1%、76.7%。结果表明，1%亚硫酸氢钠和1%偏重亚硫酸钠均能提高野黄芩苷的转化率，其中1%偏重亚硫酸钠效果更优，故选择1%偏重亚硫酸钠作为抗氧化剂。

2.3.2 酶用量对转化率的影响 取sbslGUS 提取液1.5 mL、按照酶与底物之比（以生药计）1∶5、1∶10、1∶20、1∶40，分别加入灯盏花水煎液5、10、20、40 mL，加1%偏重亚硫酸钠，于45 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”项下方法测定各酶解样品中野黄芩素含量，并计算转化率，结果分别为86.2%、82.8%、74.5%、61.9%。结果表明，野黄芩苷的转化率随着酶用量的减小而逐渐降低，酶与底物之比为1∶5 时转化率最高。考虑实际生产成本，选择酶与底物之比为1∶10，既减少酶的用量，同时也能获得较高的转化率。

2.3.3 pH 对转化率的影响 取sbslGUS提取液1.5 mL、灯盏花水煎液10 mL，加1%偏重亚硫酸钠，调节酶解体系pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5，于45 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”项下方法测定各酶解样品中野黄芩素含量，并计算转化率，结果分别为72.7%、85.2%、86.1%、85.7%，表明在pH 5.5～6.5 转化率可达85%以上，故选择酶解pH值约6.0。

2.3.4 酶解时间对转化率的影响 取sbslGUS 提取液1.5 mL、灯盏花水煎液10 mL，加1%偏重亚硫酸钠，于45 ℃水浴分别酶解10、15、20、25 h。照“2.1”项下方法测定各酶解样品中野黄芩素含量，并计算转化率， 结果分别为82.7%、 82.8%、 83.2%、84.4%。结果表明，酶解10 h 已基本酶解完全，各酶解时间转化率差异不大。

2.3.5 酶解温度对转化率的影响 取sbslGUS 提取液1.5 mL、灯盏花水煎液10 mL，加1%偏重亚硫酸钠，分别于35、40、45、50、55、60 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”项下方法测定各酶解样品中野黄芩素含量，并计算转化率，结果分别为79.9%、82.0%、82.5%、80.0%、64.4%、25.3%。结果表明，随着酶解温度的升高，野黄芩苷的转化率增加，但≥55 ℃时，野黄芩苷转化率迅速下降，提示温度过高可能会导致酶活力降低，从而影响野黄芩苷酶解，故选择酶解温度为40～45 ℃，此时野黄芩苷转化率较高。

2.3.6 抗氧化剂用量对转化率的影响 取sbslGUS 提取液1.5 mL、灯盏花水煎液10 mL，分别加0.1%、0.5%、1%、2%偏重亚硫酸钠，于45 ℃水浴酶解20 h。照“2.1”项下方法测定各酶解样品中野黄芩素含量，并计算转化率，结果分别为79.4%、82.3%、82.5%、83.4%。结果表明，野黄芩苷的转化率随着偏重亚硫酸钠用量的增加而提高，0.5%偏重亚硫酸钠即可使野黄芩苷的转化率达80%以上，从节省成本考虑，故选择添加0.5%偏重亚硫酸钠。

2.4 野黄芩素的分离 取sbslGUS 提取液1.5 mL、灯盏花水煎液10 mL，加0.5%偏重亚硫酸钠，于45 ℃水浴分别酶解10、15、20 h。测定水液和沉淀中野黄芩素的含量，计算水液中野黄芩素占比，结果分别为18.4%、13.4%、10.7%。表明酶解时间延长有利于野黄芩素的沉淀分离，酶解20 h 水液中损失较小，故酶解时间选择20 h。

综上，由灯盏花制备野黄芩素工艺拟定为：取黄芩茎叶（粉碎过40 目筛），加10 倍水（第1 次多加4 倍）室温搅拌提取3次，每次15 min，滤过，合并滤液，得sbslGUS 提取液；取灯盏花切段（黄芩茎叶10 倍量），加10 倍水（第1 次多加5 倍）煎煮提取2 次，每次1 h，滤过，合并滤液，得灯盏花水煎液；灯盏花水煎液与sbslGUS提取液混匀，加入0.5%偏重亚硫酸钠，于45 ℃酶解20 h，除去上清液，沉淀抽滤，减压干燥，即得野黄芩素粗提物。

2.5 酶解工艺放大试验 取灯盏花500 g 和黄芩茎叶50 g，按照拟定工艺进行提取酶解。试验重复3 次。结果见表6。

表6 酶解试验结果（n=3）Table 6 Results of enzymatic hydrolysis test（n=3）

2.6 野黄芩素纯化工艺研究 为进一步除去粗提物中杂质，提高野黄芩素含量，采用乙醇提取、活性炭脱色和分步结晶精制纯化粗提物。

2.6.1 野黄芩素纯化工艺参数的确定 对乙醇浓度和乙醇用量进行考察，比较70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇对粗提物中野黄芩素的提取效果。结果显示，80%乙醇中野黄芩素溶解度最大，野黄芩素与80%乙醇料液比为1∶150（m/V）时，提取效果好。比较不同活性炭用量对提取液的脱色效果，结果显示，加入相当于粗提物质量10%的活性炭，脱色效果好且野黄芩素损失小。

2.6.2 野黄芩素纯化工艺试验 取粗提物，按野黄芩素与80%乙醇料液比1∶150（m/V）加入80%乙醇加热回流30 min，再加入相当于粗提物质量10%的活性炭加热回流30 min，趁热抽滤。滤液浓缩至有明显沉淀析出，静置过夜，滤过，得沉淀Ⅰ；取滤液继续浓缩静置过夜，滤过，得沉淀Ⅱ；合并沉淀Ⅰ和Ⅱ，减压干燥，即得高纯度野黄芩素提取物。按照上述纯化工艺进行试验，重复3次，结果见表7。

表7 纯化试验结果（n=3）Table 7 Results of purification test（n=3）

野黄芩素粗提物经乙醇提取、活性炭脱色、浓缩结晶纯化后，野黄芩素含量由62%～64%提高至87%～89%。

3 讨论

野黄芩素具有不稳定的多酚羟基结构，在酶解过程中易被氧化。有报道[19-20]在制备野黄芩素时多充入氮气或加抗氧化剂保护目标产物。在预实验中考察充氮和加抗氧化剂对野黄芩苷转化率的影响，结果显示，加抗氧化剂对野黄芩素的保护效果更优。经比较抗氧化剂的种类和用量，确定加0.5%偏重亚硫酸钠。本研究探究了酶解时间对转化率的影响，结果显示酶解10 h 野黄芩苷基本酶解完全，延长酶解时间对转化率影响不大，但有利于水液中悬浮的野黄芩素沉淀，减少野黄芩素的损失，综合考虑选择酶解时间为20 h。

在考察野黄芩素的纯化工艺时，采用分步结晶对目标产物进行纯化。粗提物经乙醇提取、活性炭脱色、浓缩结晶，得到含量大于87%的野黄芩素，收率大于84%。该纯化工艺操作简便，有机溶剂可回收重复使用，适合工业化大生产。综上，本研究应用黄芩茎叶中提取得到的sbslGUS 酶解野黄芩苷制备高纯度的野黄芩素提取物，工艺简便可行，适合工业化生产，为野黄芩素化合物的制备提供了新的途径。