乙肝合并结核分枝杆菌感染患者的结核耐药基因分布情况

孟 颖, 张 倩, 支力强

(1.空军军医大学唐都医院临床检验科, 陕西 西安 710038 2.陕西省西安市第五医院检验科, 陕西 西安 710082 3.陕西省西安市红会医院关节外科, 陕西 西安 710054)

结核病(Tuberculosis,TB)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染使患者管理和结核病控制工作复杂化[1]。在2015年全球发现的1040万新结核病病例中,约120万病例同时感染了HBV病毒,并与较高死亡率(约30%)有关[2]。近年来,国内学者通过开展联合TB和HBV双向筛查提高了抗结核治疗的疗效,使患者的健康状况有所改善[2]。值得注意的是,抗药性结核病的发病率上升已成为一个主要问题。最近的建模和菌株分型数据表明,在缺乏常规药物敏感性试验的情况下,大多数在复治时诊断的耐多药(MDR)结核病病例具有原发(传播)耐药性[3]。因此,MDR-TB/HBV在医疗保健环境中存在的治疗效果不佳以及传播风险。目前,对于TB/HBV合并感染患者的结核分枝杆菌菌株多样性、传播动力学和耐药性概况的了解仍然有限。本研究检测了河南省南阳地区结核分枝杆菌菌株的多样性,并描述了该地区TB/HBV合并感染患者对一线抗结核药物耐药的频率和分子机制。

1 资料与方法

1.1菌株来源:研究对来自河南省南阳地区TB/HBV共感染患者的100株结核分枝杆菌菌株进行了回顾性实验室分析,其中Beijing谱系株最为普遍(49%),其次是EAI谱系株(35%),少数菌株包括Haarlem(2.0%)、LAM(1.0%)、MANU(3.0%)、T(4.0%)和U(6.0%)。所有菌株均于2014年至2018年从患者的痰、胸腔积液标本中分离。从实验室数据库收集人口统计数据,包括年龄、性别和居住地。

1.2药敏试验:原代分枝杆菌培养物生长在固体培养基或液体培养基上。所有被鉴定为结核分枝杆菌的菌株均采用标准比例法[3]对异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇进行了药物敏感性试验。培养物在具有以下临界药物浓度的固体培养基上生长:异烟肼(0.2μg/mL)、利福平(40μg/mL)、链霉素(4μg/mL)和乙胺丁醇(2μg/mL)。

1.3Spoligotyping、MIRU-24分型和基因测序:根据标准方案进行Spoligotyping研究,并使用国际SIVITWEB数据库(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/)和SPOTCLUST(http://cgi2.cs.rpi.edu/～bennek/SPOTCLUST.html)。根据Supply的方案(2006)对24个位点穿插重复单元(MIRU-24分型)进行了研究,并使用miru-vntrplus.org在线数据库分配使用MIRU-24分型的菌株谱系。从悬浮于200μL TE缓冲液1X(1mM EDTA,10mM Tris HCl)中的结核分枝杆菌菌落中提取DNA。将提取的DNA储存在-20℃的冷冻管中用于聚合酶链反应(PCR)分析。如前所述进行聚合酶链反应,结核分枝杆菌H37RV为阳性对照。对rpoB、katG、inhA和inhA启动子、rpsL、rrs和embB基因进行了扩增和片段分析。研究分析了6个已知与结核分枝杆菌耐药性有关的基因片段中的9个:embB基因(1个片段)、rpsL(1个片段)、rrs(2个片段)、rpoB(1个片段)、katG(2个片段)、inhA基因及其启动子。使用Bioedit Sequence Alignment Editor和Sequence Scanner软件创建每个片段的共有序列。将片段序列与H37Rv(GenBank NC.000962.3;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)进行比较以评估突变的存在。

2 结 果

2.1患者的一般资料和细菌学特征:TB/HBV合并感染病例中,大多数(63.2%)是年轻人(25～34岁)(表1)。痰涂片镜检结果占93.0%,痰涂片阳性率为38.7%。总的来说,42(42.0%)个分离株对至少一种抗结核药物具有体外耐药性;9(9.0%)个分离株为MDR,5(5.0%)个分离株对所有测试的一线药物具有泛耐药。对异烟肼的耐药率为25.0%(25/100),利福平的耐药率为10.0%(10/100),乙胺丁醇的耐药率为5.0%(5/100),和链霉素的耐药率为40.0%(40/100)。

表1 患者的一般资料和细菌学特征

2.2TB/HBV合并感染患者分离的耐药结核分枝杆菌突变:表2显示了在耐药结核分枝杆菌分离株中观察到的所有突变(包括在本研究中相同突变与抗性无关的情况)。在25个异烟肼耐药性分离株中,分别有100%和21%的katG和inhA(包括inhA启动子)发现基因突变。在异烟肼耐药株中观察到最常见的katG突变(463 G→T;Arg463Leu)。在inhA基因(Ser94Ala)中仅发现一个突变,而启动子inhA区在-15(14%)和-191(5%)位置具有突变。所有对利福平具有抗性的菌株都有rpoB基因突变;2个分离株具有一个以上的氨基酸取代(Ser531Leu和Thr481Ala;Ser531Leu和Arg529Gln)。60%的利福平耐药菌株中存在最常见的突变(531 C→T;Ser531Leu)。90%(9/10)具有利福平抗性的分离株在RRDR中具有突变(密码子507～533)。共有2株利福平耐药菌株在RRDR外有突变,1株在密码子572处,1株在密码子481处。在embB基因中发现了多个多态性(表2)。密码子378(A→C,Glu-Ala)的突变很常见,然而,它被认为是一种系统信息突变,只有1/5(20.0%)具有这种突变的菌株对乙胺丁醇具有抗性(表2)。对rpsL和rrs基因进行测序以探索与链霉素抗性相关的突变。rpsL基因的突变存在于24/40(60%)链霉素抗性分离株中;主要是密码子43(47.5%)和88(12.5%)。一个菌株在rpsL(Lys43Arg)和rrs基因的密码子1401处发生突变,这与对二线治疗的耐药性相关。rrs基因突变不太常见,存在于6/40(15%)链霉素抗性分离株中。在没有链霉素抗性的菌株中未发现rpsL或rrs基因突变。

表2 从TB/HBV合并感染患者分离的耐药结核分枝杆菌突变

2.3TB/HBV合并感染患者的结核菌株多样性和菌株相关耐药性:表3显示了观察到的结核分枝杆菌菌株多样性和菌株相关的药物抗性。Beijing谱系株最为普遍(49%),其次是EAI谱系株(35%),少数菌株包括Haarlem、LAM、MANU、T和U。59.5%存在耐药性的菌株属于北京谱系,66.7%的MDR菌株属于北京谱系。在EIA谱系菌株中,亚系EAI-5占分离株的77.1%(27/35),包括所有MDR菌株。无论是Spoligotyping还是MIRU-24都不能充分区分北京谱系菌株,但观察到的可变耐药谱并不表明存在大的传播群。

表3 TB/HBV合并感染患者的结核菌株多样性和菌株相关耐药性

2.4MDR患者中显性结核分枝杆菌菌株谱系与耐药突变之间的关联:表4反映了在MDR-TB患者中观察到的耐药性突变,均发生在Beijing和EAI谱系菌株。无论菌株背景如何,在大多数MDR分离株中发现了两个突变(rpoB Ser531Leu和katG Ser315Thr)。在9种MDR分离株中,7种(77.8%)在katG基因中具有Ser315Thr取代,1种(11.1%)在inhA基因启动子中具有-15(C-T)取代。在rpoB基因中,5个(55.6%)MDR分离株具有Ser531Leu和1个MDR分离株在RRDR区域外(在密码子572处)具有单个突变。

表4 MDR患者中显性结核分枝杆菌菌株谱系与耐药突变之间的关联

3 讨 论

本研究发现链霉素耐药性在TB/HBV合并感染患者中很常见,并且几乎普遍存在于耐药病例中。这一观察结果与最近在我国西南地区的观察结果相似,其中耐多药结核病的传播是由对所有一线药物具有泛耐药性的Beijing谱系菌株驱动[4]。在结核病控制计划中,链霉素最近(2016年)被乙胺丁醇取代,成为标准一线治疗强化阶段的第四种药物。rpsL基因43和88密码子突变占链霉素耐药菌株的60%。rrs基因的突变主要在密码子514和516处,在1400(1401)区只有一个突变,这与体外对所有二线注射药物的耐药性有关[5]。与有关TB感染患者常见的利福平单药耐药的报道相反[6],本研究在TB/HBV合并感染中未检测到利福平的单药耐药性,这种差异可能是由HBV共感染引起的。

在异烟肼耐药菌株中,密码子463的突变最常见,并且与保留的野生型katG活性有关。在本研究中,大多数异烟肼耐药菌株具有Ser315Thr取代,而在inhA基因或其启动子区域中发现极少数突变,表明绝大多数异烟肼耐药菌株在katG基因中具有突变并且与高水平的异烟肼耐药性相关。本研究中,未观察到乙胺丁醇对单一药物的耐药性。在乙胺丁醇耐药菌株中,密码子378(A→C,Glu-Ala)的突变很常见,然而,它已被认为是具有系统信息的突变,并且只有1/5(20.0%)具有该突变的菌株对乙胺丁醇的抗性[7]。密码子306在突变中的作用是不确定的,因为它通常在乙胺丁醇耐药性和易感分离株中检测到。embB密码子306、406和497中的突变均与低水平的乙胺丁醇抗性相关。

Beijing系菌株占所有菌株的近一半,并且在MDR菌株中占大多数。这与非HBV感染患者的先前发现是一致的[8]。Beijing毒株在大多数亚洲国家非常流行,在非洲部分地区的TB/HBV患者中也占主导地位[1]。在EAI谱系中,亚谱系5的比例过高,而亚谱系EAI4-VNM在非HBV感染结核病患者中最为常见。这种差异可能是由HBV共感染引起的,或者表明HBV携带者之间可能存在传播。此外,rpoB基因531密码子突变和katG基因315密码子突变与Beijing基因型及多药耐药有很强的相关性。本研究包括在本地区诊断出的有限数量的TB/HBV共感染患者,这可能并不能代表本地区所有TB/HBV共感染患者,但它为本地区TB/HBV合并感染患者的耐药性突变和结核分枝杆菌菌株多样性提供了数据支持。虽然对新发和复治结核病病例的结核分枝杆菌分离株进行评估是有意义的,但实验室数据库中没有这些信息。

总之,TB/HBV合并感染患者的结核分枝杆菌分离株显示出较高的耐药率,其中以Beijing谱系为主。需要更详细的基因组分析来探索可能影响对二线抗结核药物耐药性的传播模式和突变。