MiR-92a-3p靶向KLF4促进肝细胞癌恶性进程

蔡青山, 郑建兴, 申月玲, 吴东洋, 李树栋, 刘立友, 刘 东

(1.河北省唐山市中心医院肝胆外科, 河北 唐山 063000 2.河北省迁安市人民医院耳鼻喉科, 河北 迁安 064499)

肝癌是一种常见的癌症类型,在现代医学中受到广泛关注[1]。据统计,2020年全球有超过80万人因肝癌死亡,占因癌症死亡人数的8.3%,仅次于肺癌[2]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的肝癌,约占肝癌病例的 90%[3]。尽管在肝癌的免疫治疗等治疗方法的研究和临床应用取得了一些进展,但HCC患者的预后仍然不尽人意,复发率较高[4]。因此,了解HCC的分子机制对于寻找新的诊断和治疗策略来改善HCC患者的整体预后至关重要。MicroRNAs(miRNA)是一类长为19-25个核苷酸的内源性非编码RNA。根据完全或部分互补配对,miRNA通过靶向mRNA的3’-非翻译区(UTR)抑制靶向mRNA的表达[5]。大量研究表明,miRNA在不同的生物过程中起着重要作用,在包括癌症在内的各种疾病中都发现了miRNA的异常表达。miR-92a-3p可通过调节KLF2/BIRC5轴促进乳腺癌的增殖[6]。研究miR-92a-3p在HCC中的作用机制对于寻找HCC治疗靶点和预后标志物有重大意义。本研究通过生物信息学方法分析miR-92a-3p的靶基因,并体外培养人HCC细胞系,通过细胞功能学实验研究miR-92a-3p与其靶基因在HCC中的作用,旨在探究miR-92a-3p对HCC的影响以及分子机制。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂:人肝细胞癌细胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2、Hep3B和人正常肝细胞系HL-7702均购自中国北纳生物。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自中国Transgen公司;青霉素-链霉素、DMEM培养基、Trizol试剂、mirVana miRNA分离试剂盒、结晶紫均购自美国Thermo Fisher Scientific公司;Lipofectamine 2000试剂购自美国Invitrogen公司;PrimeScriptTMRT Master Mix、Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit均购自日本Takara公司;SYBR-Green PCR Master Mix试剂盒购自德国QIAGEN公司;一抗KLF4(ab215036)、β-actin(ab213262)、二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab6721)均购自英国Abcam公司;ECL试剂盒购自中国碧云天公司;MTT溶液购自中国索莱宝公司;二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司;pmirGLO、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2方 法

1.2.1细胞培养和转染:人肝细胞癌细胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2、Hep3B和人正常肝细胞系HL-7702均用含有10% FBS、100 IU/mL 青霉素和100 IU/mL 链霉素的DMEM培养基,置于含5% CO2的37 ℃孵育箱中进行培养。pcDNA3.1-KFL4(pcDNA3.1作为对照)、miR-92a-3p mimic、miR-92a-3p inhibitor以及相应的阴性对照购自加拿大ABM公司。使用Lipofectamine 2000试剂转染目标质粒到SMMC-7721和Bel-7402细胞系中,分组为Inhibitor NC组、miR-92a-3p Inhibitor组、mimic NC组、miR-92a-3p mimic组、mimic NC+oe-NC组、mimic NC+oe-KLF4组、miR-92a-3p mimic +oe-NC组、miR-92a-3p mimic +oe-KLF4组。细胞在相应的培养基中,在5% CO2和37 ℃的培养条件下培养备用。

1.2.2实时荧光定量PCR(Reverse transcription-quantitative PCR,qRT-PCR):为了分析HCC细胞系中的基因和miRNA表达水平,使用Trizol试剂和mirVana miRNA分离试剂盒提取了总RNA,并进行了qRT-PCR分析。使用PrimeScriptTMRT Master Mix逆转录mRNA和Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Ki逆转录miRNA。在ABI 7900HT实时PCR系统中,使用SYBR Green进行qRT-PCR检测。miR-92a-3p 以U6为内参,KLF4以β-actin为内参。所有引物序列见表1,引物均有中国Sangon Biotech公司合成。使用2-ΔΔCt计算目标基因的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB):从HCC细胞系中提取蛋白质,并将40μg蛋白质通过14.7%聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转移到聚偏氟乙烯膜上。在4 ℃下分别与一抗KLF4(1∶1000)和β-actin(1∶10000)进行孵育,过夜后用1×TBST溶液在室温下洗膜5min,冲洗3次。随后与辣根过氧化物酶标记的二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶2000)在室温下孵育2h。使用ECL试剂盒在荧光及化学发光成像系统检测蛋白条带并拍照。β-actin作为内参。

1.2.4MTT实验:细胞在96孔板中培养,每孔加入0.2mL的细胞悬液,并重复操作6次。在培养过程中的第24h、48h、72h、96h和120h,用含有20μL MTT溶液(浓度为5mg/mL)的培养基替换原始培养基,并继续培养4h。随后,吸取上清,向每个孔中加入150μL DMSO以溶解活细胞产生的甲烷基蓝晶体。在450 nm处测量每个孔的吸光度值。

1.2.5划痕愈合实验:将转染细胞以2×106个细胞/孔的密度种植在6孔板中。当细胞完全附着后,使用移液管头在每个孔中划一条直线。接下来,用PBS洗涤细胞,并在无血清培养基中继续培养48h。使用显微镜摄像头拍摄观察划痕宽度。

1.2.6Transwell:使用涂有Matrigel基质的Transwell小室进行侵袭实验。在上室中添加无血清重悬的细胞(2.5×104个/孔),下室中添加含5% FBS的DMEM培养基作为化学引诱剂。使用棉签去除留在膜上表面的未侵袭细胞,将附着在膜下表面的侵袭细胞在室温下用10%福尔马林固定30min,并用0.5%结晶紫染色。在显微镜下任意选择6个视野,计算并拍摄每个视野中侵袭细胞的数量,然后计算每个视野中细胞数量的平均值。

1.2.7双荧光素酶实验:为了验证miR-92a-3p和KLF4之间的靶向结合关系,设计含有野生型KLF4(KLF4-WT)和突变型KLF4(KLF4-MUT)的pmirGLO荧光素酶报告质粒,质粒由中国Sangon Biotech公司合成。使用Lipofectamine 2000试剂将pmirGLO-KLF4-WT/pmirGLO-KLF4-MUT与NC mimic/miR-92a-3p mimic共转染至SMMC-7721细胞。按照厂家说明书的要求,使用双荧光素酶报告基因系统检测了转染荧光素酶报告质粒和miR-92a-3p mimic/NC mimic的SMMC-7721细胞中的荧光素酶活性。

2 结 果

2.1miR-92a-3p在HCC中高表达,下调其表达可限制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭:qRT-PCR检测人类正常肝细胞系HL-7702和人类HCC细胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2和Hep3B中miR-92a-3p的表达水平。结果显示,HCC细胞系中miR-92a-3p的表达水平高于HL-7702细胞(P<0.05,图1A)。选择miR-92a-3p表达相对较高的HCC细胞系SMMC-7721和Bel-7402进行敲低miR-92a-3p处理,进行后续的功能实验。qRT-PCR结果表明,miR-92a-3p Inhibitor组中miR-92a-3p的表达水平显著低于Inhibitor NC组(P<0.05,图1B)。MTT结果表明,miR-92a-3p抑制后HCC细胞的增殖能力显著降低(P<0.05,图1C)。Transwell实验结果表明miR-92a-3p Inhibitor组的细胞侵袭能力相比Inhibitor NC组显著降低(P<0.05,图1D)。细胞划痕愈合实验结果表明miR-92a-3p Inhibitor组的细胞迁移能力相比Inhibitor NC组显著降低(P<0.05,图1E)。

图1 低表达miR-92a-3p抑制HCC细胞的增殖、侵袭和迁移

2.2KLF4可能受miR-92a-3p靶向,在HCC细胞中表达下调:从GEO数据库获取HCC表达数据集GSE49515并进行差异分析,发现共有589个显著差异表达基因(DEGs),其中249个基因在HCC中表达显著下调。接着,我们利用miRDB等数据库预测了miR-92a-3p的下游靶基因,取预测结果与GSE49515数据集中的下调DEGs交集得到了5个可能的靶基因(图2A)。表达分析显示,这五个基因在HCC中均明显低表达(图2B),其中KLF4基因在HCC中的表达变化最大(表2)。因此,我们选择KLF4作为研究对象进行分析。qRT-PCR检测正常肝细胞系HL-7702和四个HCC细胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2和Hep3B中的KLF4 mRNA表达,并发现HCC细胞系中的KLF4 mRNA表达显著低于HL-7702(P<0.05,图2C)。因此KLF4可能是miR-92a-3p的调控靶点,并且在HCC细胞中低表达。

图2 KLF4可能是miR-92a-3p的靶点,在HCC中低表达

表2 候选目标基因的差异性表达

2.3MiR-92a-3p靶向KLF4:TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)预测结果显示,KLF4 mRNA的3'UTR与miR-92a-3p存在结合位点(图3A)。进行双荧光素酶报告实验验证miR-92a-3p与KLF4的结合情况。结果表明,相比于mimic NC组,miR-92a-3p mimic组WT KLF4 mRNA 3'UTR的荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而MUT KLF4 mRNA 3'UTR的荧光素酶活性没有显著差异(P>0.05,图3B)。qRT-PCR和Western blot检测mimic NC组和miR-92-3p mimic组KLF4 mRNA和蛋白的表达水平。结果表明, miR-92a-3p mimic组显SMMC-7721细胞中的KLF4表达显著降低(P<0.05,图3C-D)。

图3 MiR-92a-3p 靶向KLF4

2.4MiR-92a-3p靶向KLF4刺激HCC细胞的发展:qRT-PCR检测不同转染组的KLF4 mRNA表达水平,发现当miR-92a-3p上调时,KLF4 mRNA水平显著下降(P<0.05)。同时,过表达KLF4可以减弱miR-92a-3p过表达对KLF4 mRNA表达的抑制作用(P<0.05,图 4A)。Western blot实验表明,与mimic NC+oe-NC组相比,mimic NC+oe-KLF4组KLF4的蛋白表达显著增高,miR-92a-3p mimic +oe-NC组KLF4的蛋白表达显著降低,而miR-92a-3p mimic +oe-KLF4组KLF4蛋白表达水平显著高于miR-92a-3p mimic +oe-NC组(图4B)。MTT实验结果显示,与mimic NC+oe-NC组相比,mimic NC+oe-KLF4组细胞增殖能力显著降低,miR-92a-3p mimic +oe-NC组细胞的增殖能力显著增高,miR-92a-3p mimic +oe-KLF4组KLF4增殖能力相比于miR-92a-3p mimic +oe-NC组显著降低(P<0.05,图4C)。Transwell和划痕愈合实验表明,与mimic NC+oe-NC组相比,mimic NC+oe-KLF4组细胞迁移、侵袭能力显著降低,miR-92a-3p mimic +oe-NC组细胞的迁移、侵袭能力显著增高,miR-92a-3p mimic +oe-KLF4组KLF4迁移、侵袭能力相比于miR-92a-3p mimic +oe-NC组显著降低(P<0.05,图4D-E)。

图4 MiR-92a-3p通过抑制KLF4的表达促进HCC细胞的生长

3 讨 论

越来越多的证据表明,miRNA的异常表达与各种癌症相关。有研究已经发现骨髓微环境中的miR-126可以控制慢性髓细胞白血病的白血病干细胞的自我更新[7]。miR-92a-3p是一个重要的miRNA,目前有关miR-92a-3p的报道显示它可以加速细胞增殖、迁移和侵袭。Zhang等[8]报道,受lncRNA MT1JP的影响,miR-92a-3p调控FBXW7,从而影响胃癌的恶性发展。Yu等[6]证明,miR-92a-3p可以通过调节KLF2/BIRC5轴促进乳腺癌增殖。本研究首先通过qRT-PCR测得miR-92a-3p在HCC中显著高表达。细胞功能实验也显示敲低miR-92a-3p对HCC的增殖、迁移、侵袭起到了抑制作用。结果表明抑制miR-92a-3p可以抑制HCC细胞的进展,miR-92a-3p在肝细胞癌中可作为促癌因子,这与前人研究的结果一致。

据报道,miRNA可以通过调节靶基因发挥其生物学功能[9]。在HCC中,通过生物信息学分析发现KLF4可能是miR-92a-3p的靶基因。KLF4是一种包含锌指的进化保守性转录因子,它在多种细胞过程中发挥作用,如细胞生长、增殖和分化。目前,KLF4已被广泛研究,研究发现它可以调节胃癌的进展[10]。此外,Xu等[11]发现KLF4在非小细胞肺癌中起抑癌作用,且受miR-3120-5p靶向调节。本研究通过TargetScan预测了miR-92a-3p与KLF4存在靶向结合位点,并通过双荧光素酶报告基因实验进行验证。随后进行细胞功能实验研究过表达miR-92a-3p和过表达KLF4对HCC细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。实验结果表明过表达KLF4可抑制HCC细胞的恶性生物学行为,而过表达miR-92a-3p可以减弱过表达KLF4对HCC细胞恶性生物学行为的抑制作用,表明miR-92a-3p对癌细胞的影响在一定程度上会削弱KLF4的作用。这说明miR-92a-3p可以通过抑制KLF4的表达来促进HCC细胞的恶性生物学行为。

综上所述,研究发现miR-92a-3p在HCC细胞中高表达,并且可能是一个有用的预后生物标志物。miR-92a-3p可以通过抑制KLF4促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。这些发现表明,miR-92a-3p/KLF4轴可能是HCC的一个潜在新治疗靶点,希望该研究能为HCC的治疗提供新思路。