PLZF的克隆及其对犏牛未分化精原细胞的增殖作用

张鹏，王明秀，敬科民，李雨谦，田园，钟金城，蔡欣

的克隆及其对犏牛未分化精原细胞的增殖作用

张鹏，王明秀，敬科民，李雨谦，田园，钟金城，蔡欣

西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省、教育部重点实验室，成都 610041

【目的】犏牛作为牦牛与黄牛的种间杂交产物，具有优良的生产性能，但其杂种优势的进一步应用却受限于犏牛雄性不育。通过克隆犏牛，明确其在犏牛和牦牛睾丸组织和未分化精原细胞中的差异表达，并进一步揭示过表达该基因对犏牛未分化精原细胞活性的影响。为阐明犏牛生精停滞的作用机制提供理论基础。【方法】以24月龄公麦洼牦牛和F1代公犏牛为实验动物，通过RT-PCR法克隆得到了犏牛的CDS序列，并进行了生物信息学分析；通过RT-qPCR法分析在犏牛和牦牛睾丸组织中的差异表达；采用同源重组的方法构建了的表达载体，并利用RT-qPCR检测了过表达效率及其下游靶基因的表达；通过PDT、CCK-8、EdU和免疫荧光检测了过表达对犏牛未分化精原细胞增殖活性的影响。【结果】克隆获得了犏牛的CDS区，并通过生物信息学分析发现该基因编码的蛋白序列不包含跨膜结构域和信号肽序列，其三级结构以α螺旋和无规卷曲为主。系统进化树分析表明犏牛与黄牛的亲缘关系更近。三级结构预测发现，虽然犏牛、牦牛和黄牛的PLZF蛋白三级结构高度相似，但牦牛PLZF蛋白在531—540位氨基酸处与犏牛和黄牛有较大差异。RT-qPCR发现，在犏牛睾丸组织和未分化精原细胞中的表达均显著低于牦牛（＜0.05），而在犏牛未分化精原细胞中过表达后，该基因的表达上调了13.8倍（＜0.01），且能显著增加犏牛未分化精原细胞的增殖活性（＜0.05），表明表达下调影响了犏牛未分化精原细胞增殖活性。此外，过表达后，犏牛未分化精原细胞中与增殖相关的基因（、、和）全部显著上调（＜0.05），与分化相关的基因（、、和）全部显著下调（＜0.05），表明通过上调增殖相关基因、下调分化相关基因的表达促进犏牛未分化精原细胞增殖。【结论】在犏牛未分化精原细胞中表达异常降低了犏牛未分化精原细胞增殖活性，导致其数量减少，影响了犏牛的精子发生。本试验为进一步阐明犏牛生精停滞的作用机制提供了理论基础，并为解决犏牛雄性不育问题提供了新的思路。

犏牛；PLZF；未分化精原细胞；增殖

0 引言

【研究意义】犏牛作为牦牛和黄牛的种间杂交产物，具有优良的杂种优势，但因F1代雄性犏牛不育而导致杂种优势无法扩大应用[1]。【前人研究进展】之前的研究发现，犏牛生精停滞的主要原因包括生精小管中细胞数量稀少及减数分裂过程受阻[2-3]。犏牛生殖细胞生态位中蛋白因子分泌不足是犏牛未分化精原细胞数量稀少重要原因[4]，而细胞自主转录因子对其增殖活性的影响也不可忽视。早幼粒细胞白血病锌指蛋白（promyelocytic leukaemia zinc finger，PLZF）是一种转录阻遏物，通过Kruppel型锌指结构域与DNA结合，并通过POZ域募集组蛋白脱乙酰酶（HDACs）来抑制转录过程[5]。最初PLZF被发现与急性早幼粒细胞白血病有关[6]。但之后的相关研究表明，PLZF的缺失会导致进行性生殖细胞的丧失、睾丸发育不良和不育[7]。PLZF在精原细胞中特异表达，并在促进SSC自我更新中发挥关键的细胞自主作用，因此PLZF被广泛用作未分化精原细胞的标记物[8-9]，另外在单细胞RNA测序的结果中PLZF也被鉴定为未分化精原细胞的标记物[10]。PLZF还可作为一种转录调节剂，能够调控靶基因的表达。目前已经发现PLZF至少以5种不同的方式发挥作用，以维持SSCs数量：①调节某些转录因子的活性（例如SALL4），以抑制分化，保持SSCs的干性[11]；②直接抑制SSCs中分化相关基因的表达（例如），刺激增殖相关基因的表达[12]；③通过上调Redd1的表达抑制mTORC1途径，抑制SSCs的分化[13]；④下调某些microRNA的表达（例如mir146a），解除microRNA对SSCs增殖相关的信号通路的抑制作用[14]；⑤抑制某些反转录转座子的活性（例如LINE1），降低反转录转座子对生殖细胞的损害[15]。PLZF与GDNF共享了多个靶基因（、、等），也能通过下调mir146a解除对CXCR4的抑制作用，因此PLZF可能处于一个信号回路，该回路能够放大或促进SSCs对增殖或自我更新相关信号通路的响应。【本研究切入点】以上研究提示可能对犏牛未分化精原细胞的增殖活性具有重要作用，而相关的研究报道较少。【拟解决的关键问题】本研究以F1代犏牛为研究对象，克隆得到序列，并检测了该基因在犏牛和牦牛睾丸组织中的表达，利用生物信息网站预测其功能，并进一步在犏牛未分化精原细胞中进行验证。这些结果将为探究对犏牛未分化精原细胞的调控作用奠定基础，并为解析犏牛生精停滞的原因提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究于2022年8—12月在四川省成都市西南民族大学青藏高原遗传资源保护与利用四川省、教育部重点实验室完成的。

1.1.1 睾丸组织采集 于2020年5月12日在四川省阿坝藏族羌族自治州红原县选取24月龄健康的公麦洼牦牛和F1代公犏牛各3头，取其睾丸组织。用灭菌PBS将睾丸组织冲洗干净，去除附睾及睾丸白膜。将睾丸组织沿纵膈切开，部分睾丸组织剪切成约2 mm3的小块后进行玻璃化冷冻处理；剩余睾丸组织直接冻存在液氮中。

1.1.2 未分化精原细胞的分离和培养 将解冻的玻璃化冷冻的睾丸组织转移至含有DMEM/F-12液体培养基培养皿中，漂洗。将漂洗后的睾丸组织转移至新的培养皿中，加入2 mL PBS，并将睾丸组织进一步剪碎，转移至50 mL离心管中。加入3 mL PBS将培养皿冲洗干净，洗涤液一并转移到离心管中。将37 ℃预热的胶原酶IV溶液加入离心管中，并添加10 μL 2 μg·mL-1Dnase I，于37 ℃、180 r/min条件下振荡消化，镜检能观察到曲细精管时停止消化。将离心管置于冰中，沉降3 min。弃上清，向沉淀中再加入10 mL 1 mg·mL-1胶原酶IV溶液和10 μL 2 μg·mL-1Dnase I，于37 ℃、180 r/min条件下振荡消化，镜检能观察到细胞散开时终止消化。将消化得到的细胞依次经70和40 μm细胞筛过滤至新的50 mL离心管中。4 ℃、350×离心6 min后，弃上清，重悬浮沉淀。混合细胞悬液培养24 h差速贴壁后，收集上清液，连续培养3代，用RT-PCR和免疫荧光进行鉴定[16]。

1.1.3 主要试剂及仪器 特级胎牛血清（FB25015，CLARK），DMEM高糖培养基（SH30021.01B，Hyclone），二氧化碳培养箱（Model 3111，Thermo），倒置荧光显微镜（Axio Observer 3，Zeiss），实时荧光定量PCR仪（A28140，Thermo），细胞计数仪（Thermo Countess II，Thermo），酶标仪（1510，Thermo）。

1.2 目的基因的获取

1.2.1 RNA的提取 将睾丸组织样品从液氮中取出，捣碎成粉末。称取组织粉末约0.1 g并置于1.5 mL Rnase-free离心管中，加1 mL Trizol，漩涡振荡混匀，室温下静置5 min。12 000 r/min、4 ℃离心5 min。取上清液至新的1.5 mL Rnase-free离心管，加入200 μL氯仿，涡旋振荡混匀，室温下静置2 min。12 000 r/min、4 ℃离心10 min。将上层的透明相吸到新的1.5 mL Rnase-free离心管中，加入500 μL异丙醇，混匀后室温静置10 min。12 000 r/min、4 ℃离心10 min。弃上清，加入1 mL 75 %乙醇洗涤沉淀。7500 r/min、4 ℃离心5 min。弃上清，加50 μL Rnase-free H2O，溶解RNA。用超微量核酸蛋白测定仪检测RNA的浓度及纯度。将剩余RNA进行逆转录反应或置于-80 ℃保存。

收集未分化精原细胞，500×、4 ℃离心6 min，弃上清。加入1 mL PBS重悬浮细胞，将细胞稀释至1×107个/mL，每个1.5 mL Rnase-free离心管分装1mL细胞悬液。500×、4 ℃再次离心6 min，弃上清。加入1 mL Trizol，混匀后静置10 min。加入200 μL氯仿，涡旋振荡混匀15 s，静置2 min。12 000 r/min、4 ℃离心10 min。后续试验步骤同组织中提取RNA。

1.2.2 逆转录PCR 利用HiScript® III RT SuperMix for qPCR（+ gDNA wiper）试剂盒（R323-01）将RNA逆转录为cDNA。

基因组DNA的去除：将4 μL 4×DNA wiper Mix、1 μL 1 μg·μL-1RNA和11 μL Rnase-free H2O在200 μL离心管中轻轻吹打混匀，42 ℃放置2 min。

逆转录反应：向上述16 μL反应液中加入4 μL 5×HiScript III qRT SuperMix，在37 ℃放置15 min，85 ℃放置5 s。将最终的产物置于-20 ℃保存。

1.2.3 引物设计与合成 根据NCBI（https://www. ncbi.nlm.nih.gov）网站中牦牛相关基因的mRNA预测序列，利用Primer premier 5.0软件设计基因克隆引物（表1），利用Primer3web（https://primer3.ut.ee）设计荧光定量PCR引物和细胞鉴定的引物（表2），利用Primer Premier5.0软件设计基因克隆引物。引物由北京擎科（成都）生物科技有限公司合成。

1.2.4 TD-PCR 在200 μL离心管中将25 μL Maxima Hot Start Green PCR Master Mix（2×）、2 μL F-primer、2 μL R-primer、2 μL cDNA和19 μL ddH2O混匀。按照表3中程序进行PCR反应，凝胶电泳检测，并进行胶回收。

表1 PLZF克隆引物

F.正向引物；R.反向引物。下划线序列表示酶切位点，加粗序列表示同源臂序列

F. Forward primer; R. Reverse primer. The underlined sequence indicates an enzyme cleavage site, and the bold sequence indicates a homologous arm sequence

表2 RT-qPCR引物序列

表3 RT-qPCR反应程序

反应程序：95℃预变性5 min，[95 ℃变性30 s，65℃退火30 s（每一个循环降1℃），72℃延伸3 min] 15个循环，[95 ℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min] 20个循环。

1.3 表达载体的构建

1.3.1 目的基因与载体的连接 采用OK Clon连接试剂盒（AG11807）。将pcDNA3.1（+）空载质粒用HI和dIII于37℃双酶切16 h，制备线性载体。用带有同源臂的克隆引物克隆，并经胶回收后纯化。将8 μL 2.5×OK Clon Master Mix、5 μL（100 ng）、4 μL线性pcDNA3.1+载体（100 ng）和3 μL Rnase-free H2O加入200 μL离心管中，配成连接反应液，50℃放置15 min。取10 μL 连接反应液，加入100 μL感受态细胞中，混匀，冰浴30 min后，42℃水浴45 s。之后迅速置于冰上2 min。加入900 μL LB液体培养基，37℃、200 r/min培养1 h。取100 μL菌液均匀涂布于带有Amp抗性的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养16 h。然后进行阳性克隆筛选。

1.3.2 质粒回收 利用FsatPure EduoFree Plasmid Maxi Kit（DC301）进行pcDNA3.1（+）-PLZF表达载体回收。取150 mL过夜培养的菌液，11 000 r/min离心2 min，弃上清液，收集菌体。向离心管中加入7.5 mL Buffer P1，涡旋振荡混匀至看不到细菌团块。加入7.5 mL Buffer P2，上下颠倒8次，室温放置5 min。加入7.5 mL Buffer P4，上下颠倒8次，11 000 r/min离心15 min。取上清液至新的离心管中，加入0.1倍体积的内毒素清除剂，冰浴5 min后，室温放置15 min。11 000 r/min离心10 min，取上层水相至新的离心管中。加入0.5倍体积的异丙醇，颠倒混匀，转移到吸附柱中，11 000 r/min离心1 min。弃滤液，加入10 ml 漂洗液，11 000 r/min离心1 min。弃滤液，再次加入10 mL漂洗液，11 000 r/min离心1 min。弃滤液，11 000 r/min离心3 min。将吸附柱放置于新的离心管中，加入1 mL Buffer TB，室温放置3 min，11 000 r/min离心3 min。将收集的质粒置于-20℃保存。

1.4 表达载体转染细胞

本研究采用的是Yeasen公司的Hieff Transfection Reagent试剂（40802ES02）。用不含血清和双抗的生精培养基将未分化精原细胞稀释至1×106个/mL，每24孔板加入500 μL细胞悬液。用50 μL DMEM/F-12培养基稀释0.5 μg 1.3.2中获得的pcDNA3.1（+）-PLZF表达载体，混匀。用50 μL DMEM/F-12稀释4 μL 脂质体转染试剂，并在室温放置5 min。将稀释的pcDNA3.1（+）-PLZF表达载体和转染试剂混合，室温孵育20 min。将100 μL DNA-转染试剂加入到24孔板中，摇动培养板，轻轻混匀。37℃、5% CO2培养6 h后，向培养基中补加55 μL FBS和300 μL不含双抗的培养基，24 h后提取细胞RNA，测定转染效率。

1.5 细胞增殖检测

1.5.1 细胞群体倍增时间 参照文献[17]的方法测算细胞群体倍增时间（population doubling time，PDT），将牦牛和犏牛的未分化精原细胞接种于12孔板中，浓度为2×106个/mL，终体积为1.5 mL。分别于不同的培养基中进行培养。每种处理3个重复。在培养48 h后，用Countess® II进行细胞计数。按照公式（1）

PDT=[log2/（logNt-logN0）]×t （1）

计算细胞群体倍增时间，其中，t为培养时间，N0为初始培养的细胞数量，Nt为培养t时间后的细胞数量。

1.5.2 CCK-8 将牦牛和犏牛的试验组和对照组的未分化精原细胞接种于96孔板中，浓度为2×104个/mL，终体积为100 μL。分别于不同的培养基中进行培养。每种处理5个重复。在0、24、48、72和96 h时分别加入10 μL CCK-8 Solution（A311），在37℃培养箱中孵育2 h，用酶标仪检测450 nm处的吸光值。

1.5.3 EdU染色 按照BeyoClickTMEdU-594细胞增殖检测试剂盒（C0078S）说明书，向12孔板培养的未分化精原细胞中加入1.2 μL EdU工作液，37℃孵育2 h。收集悬浮培养的未分化精原细胞，350×、4℃离心6 min后弃上清，用1 mL PBS重悬浮并稀释至1×105—5×105个/mL。将200 μL 细胞悬液置于多聚赖氨酸处理的玻片上，待大部分液体变干后用免疫组化笔标记位置，并将玻片置于湿盒中。用200 μL 4% 多聚甲醛固定30 min后，用100 μL 2% Triton X-100渗透20 min。用200 μL Click反应液孵育30 min，细胞核用H33342染色10 min，在倒置荧光显微镜下拍照。

1.5.4 免疫荧光 收集悬浮生长的细胞，350×、4℃离心6 min后弃上清，用1 mL PBS重悬浮并稀释至1×105—5×105个/mL。将200 μL细胞悬液置于多聚赖氨酸处理的玻片上，待大部分液体变干后用免疫组化笔标记位置，并将玻片置于湿盒中。用200 μL 4% 多聚甲醛固定10 min。PBST清洗3次，5 min/次。滴加100 μL PBSX孵育样品 20 min。PBST 洗涤2次，5 min/次。100 μL 3% BSA封闭2 h。去除BSA，滴加DDX4抗体（ab13840，1﹕200）150 μL，4 ℃避光孵育15 h。弃一抗，并经PBST 洗涤3次，15 min/次。滴加Alexa Fluor®488（ab150077，1﹕500）150 μL，避光孵育2 h。用PBST洗涤细胞3次，15 min/次。加入DAPI染色液覆盖样品，放置10 min。PBST洗涤2次，5 min/次。滴加少量抗淬灭剂，盖上盖玻片，在倒置荧光显微镜下观察。

1.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒（Q711）进行实时荧光定量PCR反应。在200 μL离心管中将10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、0.4 μL F-primer、0.4 μL R-primer、1 μL cDNA和8.2 μL ddH2O混匀。按照表3中程序进行RT-qPCR反应。

1.7 统计与分析

RT-qPCR以为内参，采用ΔΔCt法分析。使用GraphPad Prism 9.0.0统计软件（GraphPad Inc.，美国）进行单因素方差分析，以确定是否具有统计学意义的差异（＜0.05或＜0.01）。除非另有说明，否则每组试验重复至少3次。

2 结果

2.1 PLZF克隆

以犏牛睾丸组织cDNA为模板，通过TD-PCR获得与预期目的片段大小相同的条带，回收纯化后连接pcDNA3.1（+）载体，转化大肠杆菌，菌落PCR鉴定后送测序。结果表明，成功克隆得到PLZF的基因的CDS区2 022 bp，编码673个氨基酸残基，其3′端和5′端分别带有dIII和HI酶切位点及一段15 bp的同源臂序列（表1，图1）。Blasten分析表明，犏牛与GenBank中牦牛、黄牛、瘤牛、猪和山羊的核苷酸相似性分别为98.96%、99.80%、99.75%、94.07%和97.23%，且黄牛、瘤牛、山羊和猪的CDS区长度都为2 022 bp，仅牦牛的CDS区长度为2 019 bp（表4）。通过DNAMAN软件对上述6个物种的CDS区进行序列比对，结果表明犏牛的CDS区在第344位、602位和1827位的核苷酸与其他物种均存在差异（图2-A—C）。此外，相比其他物种，牦牛PLZF基因缺少的3个核苷酸位于1 616— 1 618位；犏牛与牦牛PLZF基因的主要差异在1 595— 1 618位，而该区域犏牛与黄牛PLZF基因序列没有差异（图2-D）。

P和M分别表示PLZF和Marker

表4 不同物种PLZF的CDS区序列对比

图2 不同物种PLZF的CDS区序列比对

2.2 PLZF生物信息学分析

生物信息学分析结果表明，PLZF蛋白分子式为C3223H5073N911O1007S49，分子量为74 267.18 u，等电点PI为5.98，在哺乳动物离体网织红细胞中的半衰期为30 h，不稳定系数为57.17，脂肪系数为69.47。TMHMM预测结果显示，犏牛PLZF蛋白没有跨膜区域（图3-A）；信号肽预测结果显示，犏牛PLZF蛋白不存在信号肽序列（图3-B）。犏牛PLZF蛋白亲/疏水性预测最大值是2.544（第492位半胱氨酸），最小值是-3.187（第147位天冬氨酸），总亲/疏水系数为-0.450，在126—153，293—332，553—629、639—666等区域有较强的疏水性（图3-C）。SPOMA预测结果显示，犏牛PLZF蛋白中无规卷曲占比最高，为49.48%，α螺旋为37.44%，β折叠为10.10%（图3-D）。利用MEGA7.0软件对犏牛及Genbank中9个不同的物种PLZF基因序列构建系统进化树，如图3-E所示，犏牛与黄牛（）亲缘关系最近，其次是瘤牛（）及瘤牛和黄牛的杂交种（×），牦牛（）居第四位，其后依次是水牛（）、绵羊（）、山羊（）、猪（）和人（）。

A为跨膜结构域预测分析。B为亲/疏水性预测分析。C为信号肽序列预测分析。D为蛋白质二级结构预测分析。E为PLZF基因序列系统进化树

通过DNAMAN软件对犏牛、牦牛和黄牛PLZF蛋白的氨基酸序列进行序列比对，结果发现牦牛与犏牛和黄牛氨基酸序列差异主要位于531—539位氨基酸，且牦牛在此区域缺少一个氨基酸残基，而犏牛和黄牛PLZF蛋白在此区域的氨基酸序列没有差异（图4-A）。但犏牛与牦牛和黄牛的PLZF蛋白在第609位氨基酸残基处出现差异，犏牛在该位点的氨基酸为半胱氨酸，牦牛与黄牛则是精氨酸（图4-B）。通过SWISS-MOFEL在线网站预测了犏牛、牦牛和黄牛PLZF蛋白的三级结构，发现三种牛的PLZF蛋白三级结构高度相似，均以α螺旋和无规卷曲为主，几乎没有β折叠结构（图4-C-E）。牦牛PLZF蛋白在531—540位氨基酸残基处的结构与犏牛和黄牛差异较大，且在该位点的两个苯环均来自脯氨酸，相距较远，而犏牛和黄牛PLZF蛋白在该位点的两个苯环均来自组氨酸，相距较近（图4-F—H）。犏牛PLZF蛋白在609位氨基酸残基虽然与牦牛和黄牛不同，但其结构并没有太大的差异（图4-I—K）。

A和B为犏牛、牦牛和黄牛PLZF氨基酸序列差异分析。C-E为犏牛、牦牛和黄牛PLZF蛋白三级结构预测。F-K为犏牛、牦牛和黄牛PLZF蛋白结构差异分析

2.3 PLZF在牦牛和犏牛睾丸组织中的差异表达

以为内参基因，利用RT-qPCR检测在牦牛和犏牛睾丸组织中的检测。结果显示，在犏牛睾丸中的表达显著低于在牦牛中的表达（图5，＜0.01）。

2.4 PLZF表达载体的构建

基因片段纯化后，与经过dIII和HI双酶切的线性质粒pcDNA3.1（+）通过同源重组的方式进行连接。将连接产物转化到感受态细胞，挑取阳性菌落扩繁后测序，并菌液质粒进行双酶切鉴定。

结果显示，pcDNA3.1（+）-PLZF表达载体酶切后的产物在2 000 — 8 000 bp之间有2条阳性条带，分别与条带和线性pcDNA3.1（+）条带大小一致（图6-A），且测序结果与预测序列一致，表明pcDNA3.1（+）-PLZF表达载体构建成功。

YK表示牦牛，CY表示犏牛（下同）。**表示P＜0.01

2.5 PLZF过表达效率

在犏牛未分化精原细胞中的表达量显著低于牦牛（图6-B，＜0.05）。将pcDNA3.1（+）-PLZF表达载体导入犏牛未分化精原细胞，诱导24 h后收集细胞，检测其过表达效率。结果表明，与CY相比，CY-PLZF中PLZF表达量上调了约13.8倍（图6-B，＜0.01）。

A：pcDNA3.1（+）-PLZF表达载体的酶切鉴定。M、1、2和3分别表示Marker、表达载体双酶切、PLZF基因克隆和线性pcDNA3.1（+）空载体；B：PLZF基因的过表达效率。不相同字母的柱状图表示有显著差异（P＜0.05）。CY-PLZF表示犏牛未分化精原细胞中PLZF基因过表达。下同

2.6 过表达PLZF对犏牛未分化精原细胞的影响

如图7-A所示，CY-PLZF中PDT均显著低于CY，与YK无显著差异（＜0.05）。CCK-8结果显示，CY-PLZF的增殖活性均显著高于CY-，但低于YK（图7-B，＜0.05）。EdU染色结果显示，过表达后犏牛未分化精原细胞增殖活性增强（图7-C）。免疫荧光结果显示，过表达能增加DDX4阳性细胞的数量（图7-D）。

2.7 过表达PLZF对犏牛未分化精原细胞增殖和分化相关基因的影响

如图8所示，过表达后，与增殖相关的基因（、、和）全部显著上调（＜0.05），且和表达量显著高于牦牛（＜0.05），与分化相关的基因（、、和）全部显著下调（＜0.05）。

图8 PLZF靶基因在犏牛未分化精原细胞中的表达

3 讨论

3.1 PLZF的克隆及生物信息学分析

PLZF是未分化精原细胞的自主转录因子，对未分化精原细胞的命运调控至关重要[18-19]。本试验得到的犏牛的CDS区为2 022 bp，编码673个氨基酸残基，并将犏牛的CDS区翻译成氨基酸序列，分析了其蛋白特征信息、预测了其二级结构和三级结构。

二级结构分析结果表明，PLZF蛋白没有跨膜结构域及没有信号肽区域，与其属于转录因子的亚细胞定位一致。系统进化树分析发现，犏牛与黄牛的相似度比牦牛高，进一步进行序列比对后发现，牦牛的CDS区在1 616 — 1 618位点比犏牛和黄牛少3个核苷酸，且在相邻的CDS区域中牦牛与犏牛、黄牛的核苷酸序列差异较大，由此造成了牦牛PLZF蛋白在531—540位氨基酸残基处的结构与犏牛和黄牛有较大差异。但这种差异对不同牛种PLZF蛋白的影响还需进一步的研究。

另外，通过比对犏牛和不同物种的CDS区，发现犏牛的CDS区在344位、602位和1827位的核苷酸与其他物种均不同。通过比对氨基酸序列发现，344位和602位核苷酸的改变并不会影响氨基酸种类，但1 827位的核苷酸的差异导致犏牛PLZF蛋白中609位的氨基酸残基与牦牛和黄牛不同，但对犏牛PLZF蛋白的结构似乎并没有影响。

3.2 PLZF的低表达对犏牛未分化精原细胞的影响

在犏牛睾丸组织和未分化精原细胞中的表达水平均显著低于牦牛，且CY组未分化精原细胞增殖活性也显著低于YK组，表明在犏牛未分化精原细胞中的异常表达会影响其增殖。而将pcDNA3.1（+）-PLZF过表达载体导入犏牛未分化精原细胞后，的表达显著上调，犏牛未分化精原细胞增殖活性显著增加，细胞群体倍增时间明显缩短，表明能促进犏牛未分化精原细胞的增殖，以维持未分化精原细胞数量，这与BUAAS等[7]研究结果一致。

Bcl6b与精原干细胞自我更新密切相关[20]，c-fos能促进精原干细胞进入有丝分裂S期[21]，而CY组中和的表达显著低于YK组，表明犏牛未分化精原细胞增殖活性下降的原因是增殖相关基因的异常表达。此外，上述两个基因都受到的调控[14]，表明在犏牛未分化精原细胞中表达下调影响力增殖相关基因的表达，造成了其增殖活性的降低。WU等[22]观察到犏牛生精小管中精原细胞数量显著低于牦牛，因此可以推断，表达异常影响了犏牛的增殖活性，会导致犏牛精原细胞数量减少。

3.3 PLZF过表达能促进犏牛未分化精原细胞的增殖

过表达以后，与分化相关基因（、、和）的表达在CY-PLZF中均显著下调，表明PLZF能抑制分化相关基因的表达，这与Song等[23]研究结果一致；与增殖相关的基因（、、和）的表达均显著上调，表明PLZF能促进增殖相关基因的表达，但PLZF作为转录抑制因子，不能直接上调基因的表达[24]，因此，PLZF上调这些基因的表达可能通过抑制某些分化相关转录因子的活性或者抑制某些miRNA的活性，以解除该因子或miRNA对增殖相关基因或通路的抑制，间接上调增殖相关基因的表达。例如，被PLZF抑制的转录因子Sohlh2能抑制增殖相关基因的表达，上调、等分化相关基因的表达[25]；而miR146a也能被PLZF抑制进而激活CXCR4通路，促进未分化精原细胞增殖[26]。

3.4 单一地过表达PLZF不能完全拯救犏牛生精停滞

CY-PLZF中的表达显著高于YK组，增殖相关基因和的表达显著高于YK组，且分化相关基因（、、和）的表达均显著低于YK组，但CY-PLZF组未分化精原细胞的活性却并没有高于YK组，这表明除了以外，仍存在其他因素影响犏牛未分化精原细胞的增殖，例如外源性细胞因子FGFs家族蛋白[27]、GDNF蛋白[28]及其他的细胞转录因子FOXO1[29]、TAF4b[30]等，这仍需要在犏牛中更多的研究来进行验证。

SNIPPERT等[31]的研究表明位于生态位中的干细胞优先进行自我更新，溢出生态位的干细胞才能进入分化。因此，犏牛未分化精原细胞中的异常表达导致其增殖活性降低会使其干细胞数量不足，进而影响干细胞数量，导致溢出生态位的干细胞减少，进而影响犏牛的精子发生。PLZF在犏牛未分化精原细胞中过表达后，增加了其增殖活性，但对犏牛精子发生的影响还需更多的试验进行进一步的研究（图9）。

图9 PLZF对犏牛未分化精原细胞增殖的影响

4 结论

本试验成功克隆得到了犏牛，并分析了PLZF蛋白在犏牛、牦牛和黄牛中三级结构的差异。在犏牛未分化精原细胞中表达下调会降低其增殖活性，导致犏牛未分化精原细胞数量稀少，进而影响犏牛的精子发生；而过表达能显著上调增殖相关基因表达和抑制分化相关基因的表达，增加犏牛未分化精原细胞的增殖活性。这些结果为探究PLZF对犏牛未分化精原细胞的调控作用奠定细胞学基础，并为进一步阐明犏牛生精停滞的作用机制提供理论基础。

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Cloning of PLZF Gene and Its Effects on the Proliferation of Undifferentiated Spermatogonia in Cattleyak

ZHANG Peng, WANG MingXiu, JING KeMin, LI YuQian, TIAN Yuan, ZHONG JinCheng, CAI Xin

Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization, Ministry of Education / Sichuan Province, Southwest Minzu University, Chengdu 610041

【Objective】As the product of interspecific hybridization between yak and cattle, cattleyak has excellent production performance, but the further application of its heterosis is limited by the male sterility of cattleyak. The aim of the study was to clone theof cattleyak, and to identify its differential expression in the testicular tissue and undifferentiated spermatogonia of cattleyak and yak, and to further reveal the effect of expressing this gene on the activity of undifferentiated spermatogonia of cattleyak. This study could provide a theoretical basis for clarifying the mechanism of spermatogenesis stagnation in cattleyaks. 【Method】 In this study, 24-month-old male Maiwa yak and F1generation male cattleyak were used as experimental animals, and the CDS sequences ofin cattleyak were cloned by RT-PCR and analyzed by bioinformatics. The differential expression ofin the testis tissues of cattleyak and yak was analyzed by RT-qPCR. The expression vector ofwas constructed by homologous recombination, and the overexpression efficiency and the expression of downstream target genes were detected by RT-qPCR. The effect of overexpression ofon the undifferentiated spermatogonia of cattleyak was detected by PDT, CCK-8, EdU, and immunofluorescence. 【Result】The CDS region of thewas cloned, and it was found by bioinformatics analysis that the protein sequence encoded by the gene did not contain transmembrane domain and signal peptide sequence, and its tertiary structure was mainly α helix and random curl. Phylogenetic tree analysis showed that theof cattleyak was more closely related to theof cattle. The prediction of tertiary structure showed that although the tertiary structure of PLZF protein of cattleyak, yak and cattle was highly similar, the PLZF protein of yak was quite different from that of cattleyak and cattle at amino acids 531-540. RT-qPCR found that the expression levels ofgene in the testis tissue and undifferentiated spermatogonia of cattleyak were significantly lower than that in yak (＜0.05). After overexpression of, the expression ofin the undifferentiated spermatogonia of the cattleyak was up-regulated by 13.8 times (＜0.01), and the proliferation activity of the undifferentiated spermatogonia of the cattleyak was significantly increased (＜0.05), which showed that the down-regulation ofexpression affected the proliferation activity of undifferentiated spermatogonia of cattleyak. In addition, after overexpression of, the proliferation activity of undifferentiated spermatogonia was significantly increased All proliferation-related genes (,,and) were significantly up-regulated (＜0.05), and all differentiation-related genes (,,and) were significantly down-regulated (＜0.05), indicating thatcould promote the proliferation of undifferentiated spermatogonia by up-regulating the expression of proliferation-related genes and down-regulating the expression of differentiation-related genes.【Conclusion】The abnormal expression ofin cattleyak undifferentiated spermatogonia reduced the proliferative activity of cattleyak undifferentiated spermatogonia, resulting in its decrease in number and affecting the spermatogenesis of cattleyak. This study provided a theoretical basis for further elucidation of the mechanism of spermatogenesis and stagnation in cattleyak, and a new idea for solving the problem of male sterility in cattleyak.

cattleyak; PLZF; undifferentiated spermatogonia; proliferation

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.02.013

2023-05-11；

2023-10-07

西南民族大学“双一流”项目（XM2023019）、四川省科学技术厅应用基础科技项目（2021YJ0268）

张鹏，E-mail：zhangpeng0536@126.com。通信作者蔡欣，E-mail：caixin2323@126.com。通信作者钟金城，E-mail：zhongjincheng518@126.com

（责任编辑 林鉴非）