微波辅助顶空固相微萃取GC-MS法分析柠檬草中挥发性成分

杨玉贤，张 琼，杨绍坤，高云涛，和顺琴*

(1.云南医药健康职业学院，云南 昆明 650033；2.云南民族大学，云南 昆明 650500)

柠檬草(CymbopogoncitratusDC.Stapf)，学名香茅，亦名柠檬香茅，具有柠檬香气，为草本香料[1]，可作为传统调味品使用，也可入药[2-4]，其标志性成分有橙花醛、香叶醛、柠檬烯、香茅醛及香叶醇等[5]。主要在东半球热带及亚热带地区被广泛种植[6]，在中国，主要生长在两广、福建、海南、台湾等地区[7-8]。柠檬草性温，味辛、甘，具有祛风通络、温中止痛、止泻的功效，也可用于治疗风寒湿痹、脘腹冷痛、泄泻、跌打损伤以及由感冒引起的头身疼痛等，其挥发性成分还具有安神、镇静、助眠的功效[9-11]。

挥发性成分的分析在香料风味特性[12]、天然产物化学的研究[13]以及生态环境监测、食品质量控制、传统中医药研究[14]以及工业过程等领域发挥着重要的作用[12，15]。微波辅助萃取(MAE)则利用微波对含有植物原料的萃取溶剂进行加热，是近年来采用的一种从植物中提取挥发性组分的有效方法之一[16]。微波顶空固相微萃取是将微波同顶空固相微萃取技术相结合，可显著改善其效率，逸出更多的挥发性成分。目前，有关柠檬草化学成分研究报道中多采用气相色谱法、液相色谱法和原子吸收法等，这些方法均为柠檬草的质量评价提供了较好的参考。但其采用前处理方法，如超临界CO2萃取法、水蒸气蒸馏法和超声溶剂萃取法等均存在过程复杂、受基质影响损失较大等问题[17-18]，可通过研发操作更简单更经济的的聚焦微波反应器来改善。本文设计出一种新的，简单易制作、小型高效的微型底聚焦微波顶空固相微萃取(MA-HS-SPME)装置，利用样品自身所含水分吸收微波，无需添加溶剂，即可达到提取挥发性成分的目的，将其有效应用于提取柠檬草样品及其他植物挥发性成分的研究。

1 材料与方法

1.1 材料试剂及仪器设备

材料：SHF卧式铝制轴承座、铝管、N母头带法兰盘聚能辐射、微带螺旋天线、四氟垫片、箔片。柠檬草样品产自广西东兴地区，购于东南亚特色美食坊宝食品店，将购买的新鲜柠檬草样品的叶片及根茎部分清洗干净，叶片切成小段，根茎分别从横、纵截面切开、风干，取准备好的叶片和根茎放入粉碎机中分别研磨至60目以下，备用。

试剂：蒸馏水。

仪器设备：STA449 F3型同步热分析仪(德国耐驰仪器有限公司)；ISQ120839 THERMOFISHER(ISO)气-质联用仪(美国赛默飞世尔科技公司)；57328-U 50/30 μm(DVB/CAR/PDMS)固相微萃取SPME纤维头(美国Supelco公司)；多功能粉碎机(旭朗，WN-300型)；20 mL 钳口顶空瓶；微型底聚焦微波反应器(实验室自制)。

1.2 微型底聚焦微波反应器

本文基于传统微波谐振腔的研究和近场微波原理，并针对新型微波前处理体系研究需要，放弃已有的磁控管-波导-谐振腔馈能的传统结构，由0～100 W 小功率的半导体固态微波源和微型的腔体组成，利用N型接头连接内导体和外导体，导体包括内、外导体以及介质；腔体包括轴承座、样品腔和反射腔，通过SHF卧式铝制轴承座将反射腔连接起来，再用氧化铝合金架将轴承座和反射连接组成上部的样品腔，用联华高温透明玻璃椭球底顶空瓶作为反应器以及螺旋式上升微带螺旋天线，研制出一种可用于顶空微萃取的固态微波源-同轴输出-天线馈能的微型底聚焦微波反应器。其由半导体固态微波功率源和微腔体温和可控微波反应装置两部分组成，同时还设计了专用的控制软件系统，微波功率源控制器设有控温模块，通过功率与时间的控制，可较准确控制反应过程中的温度，以及进行连续式或每秒上百万次的脉冲微波馈能，克服了谐振式反应器的诸多不足，具有微波单模腔能量功率高、升温稳定可控的特点。而与已有侧面聚焦微波系统对比，则反应效率更高、体积小巧、可进行微小量样品的处理、易于实现批量化处理，其可通过微波辐射天线从反应器底面将微波能定向馈入底部样品，避免了微波能消耗加热溶剂，利于对过程进行更精准的控制，并可与后续GC、HPLC、GC-MS等色谱进样系统匹配，方便与微萃取、酶解和衍生过程集成，明显提高处理速度和反应效率，故可将该底聚焦微波反应器应用于柠檬草等实际样品的微波顶空分析，该装置如图1所示。

图1 底聚焦微波反应器结构

1.3 方法

1.3.1 底聚焦微波反应器性能验证测试

1)微波泄露检测

本文研制的微型底聚焦微波反应器，用于柠檬草样品粉末的升温操作，并用微波辐射检测仪检测微波泄露。

2)红外热成像分析

准确称取柠檬草样品粉末 0.50 g 于 10 mL 联华高温透明玻璃椭球底顶空瓶中，钳紧顶空瓶盖进行密封，分别用常规加热(水浴、油浴或金属浴)和固定其它条件，微波功率为 20 W，微波条件下处理2 min的方式，用TESTO 865红外线热成像仪测定反应体系的热场温度，记录底部样品温度的变化并进行分析。

3)升温速率测定

准确称取柠檬草样品粉末 0.50 g 于 10 mL 联华高温透明玻璃椭球底顶空瓶中，钳紧顶空瓶盖进行密封，固定其它条件，微波条件(微波时间：1、2、3、4 、5 min；微波功率：10、20、30、40、50 W处理，用TESTO 865红外线热成像仪测定反应体系的热场温度，记录底部样品温度的变化并进行分析。

4)温差体系分析

按照前边论述的3)的微波条件，固定其它条件，用TESTO 865红外线热成像仪测定反应体系的热场温度，记录底部样品与顶空瓶顶部温度的变化并进行计算和分析。

1.3.2 顶空固相微萃取

采用固相微萃取SPME纤维头和SPME纤维组件支架共同组装而成的固相微萃取装置，称取柠檬草粉末样品 0.5 g，30 W 条件下萃取 15 min，按照文献[18]顶空测试微萃取方法进行操作，进行后续GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS 分析

色谱条件：色谱柱：DB-WAX(30 m×0.25 m×0.25 μm)毛细管色谱柱；进样口温度：220 ℃，检测器温度：220 ℃；柱初温 45 ℃，保持 3 min，以 10 ℃/min 升到 90 ℃ 持续 2 min；以 6 min 升到 200 ℃，保持 5 min；高纯氦气(纯度φ>99.999%)；载气流速 1.0 mL/min；分流比∶10∶1；解析时间∶3 min，保留时间 3 min。

质谱条件：电子轰击离子源(EI)离子源；传输线温度 280 ℃；离子源温度 260 ℃；电子能量 70 eV；质量扫描范围 30～500m/z。

1.3.4 挥发性成分的分析

柠檬草样品中各挥发性成分通过质谱工作站Xcalibur 3.0对色谱峰进行定性和半定量分析。通过计算机检索，由仪器所配置的NIST 11标准质谱图数据库进行检索匹配分析，将相似度(SI与RSI值均大于800)的组分先进行选择，再结合保留时间及参考相关文献[19-20]，按峰面积归一化法计算，对GC-MS检测结果进行鉴定，确定相应化合物的名称和各挥发成分在萃取物中的相对含量。见式(1)。

(1)

式中：A1为单组分挥发性风味成分的峰面积；A2为挥发性风味成分总峰面积。

2 结果与分析

2.1 微波泄露测定

微波泄露用微波辐射检测仪检测，此装置的微波辐射泄露为 0.03 mW/cm2(明显小于微波对人体健康产生危害的我国标准：1.00 mW/cm2和国际标准：5.00 mW/cm2)，如图2所示。

(a)实物图 (b)红外图

2.2 红外热成像分析

传统上，已有的从外部热源(如水浴、油浴或金属浴)进行常规加热方式(图3a，3b)，其不仅需要较大的腔体结构，而且通常采用较大功率的微波能以保证足够功率密度，温度极难控制，极易在样品区域形成过热，使顶空瓶底面与顶部之间难以形成较大的温度差区域，是一种低能量且缓慢的传递方式。而微型底聚焦微波是将样品置于底面聚焦微波腔中，放弃传统微波反应器的谐振腔结构，使用波导直接将微波能从反应容器底面定向馈入样品，通过聚焦腔向待处理样品馈入微波能量(图3c)，与传统的加热方式有很大不同，结果如图3所示。

(a)家用微波炉(700 W, 3 min) (b)金属浴(50 ℃, 30 min) (c)微腔体微波(20 W, 2 min)

2.3 升温曲线分析

升温速率测试表明，不同微波功率随时间的升温曲线在所研制的微型底聚焦微波反应器内，系统能量密度高、馈能均匀，在短时间内只需10～50 W 的小功率微波就有较快的升温速率，可达到较高温度，微波聚焦馈能效率较高。微波功率与微波时间之间对应形成的温度呈现出良好的线性关系趋势，利于温度的准确调节控制，如图4所示。

图4 微波功率与微波时间对应形成的升温曲线

2.4 温差曲线分析

在任何顶空SPME采样的温度分布中，通常都有一个上升段和一个下降段，它们之间存在一个最佳温度[21-22]。微型底聚焦微波反应器恰好可使样品与萃取区形成两个区域，在短时间内使底部样品达到一定温度，使纤维涂层和样品基质之间形成显著的温度差。微波功率和处理时间与体系温度增加呈现较好的线性关系，不仅随着微波时间的不断增加，温度逐渐出现平缓的趋势，而且明显可以看出不同微波功率与微波时间相对应的温度与随时间产生的上下温度差曲线呈现正比的趋势，可通过调节功率来调节温度变化。上下温度间隙的形成增强了样品基质中挥发性成分的释放以及在顶空中的扩散和对流，对于挥发性成分而言，增加了纤维涂层上的捕获能力，使提取萃取率提高，增加可控性，有效保护了固相微萃取纤维头，这使反应过程中的副产物产生的几率减少以及对于准确性的控制具有重要意义，结果如图5所示。

图5 不同微波功率与微波时间相对应的上下温差升温曲线

2.5 GC-MS分析

本文利用微型底聚焦微波反应装置与固相微萃取装置，结合微波顶空气相色谱-质谱联用 (GC-MS)分析研究了柠檬草挥发性成分，如图6：a和b分别是叶片和根茎经微波处理，c和d分别是叶片和根茎经金属浴处理后顶空固相微萃取萃取物的GC-MS总离子流图。 叶片和根茎中各类挥发性成分的种类和相对含量按1.3.4挥发性成分的分析进行统计汇总，如表1所示。

(a)叶片,微波处理 (b)根茎,微波处理

(c)叶片, 金属浴处理 (d)根茎, 金属浴处理

表1 柠檬草叶片和根茎萃取物中的挥发性成分

表1(续)

从表1可以看出，经微波处理，从柠檬草叶片和根茎中分别鉴定出37种、46种挥发性成分；经金属浴处理，从叶片和根茎中分别鉴定出29种、42种挥发性成分。主要成分的组成差别不大，均以醛类、醇类和烯烃类物质为主。其中，微波条件处理下叶片(89.93%)和根茎(77.29%)的萃取物挥发总量均优于金属浴条件处理下叶片(81.48%)和根茎(63.62%)的挥发总量。在微波和金属浴条件处理下的叶片和根茎中含量较高的挥发性成分都是橙花醛和香叶醛，且微波条件处理获得叶片中的主要挥发性成分橙花醛(29.27%)和香叶醛(22.14%)的相对含量要明显优于金属浴条件下根茎中橙花醛(8.61%)和香叶醛(7.76%)的相对含量。柠檬草精油有较好的抑菌活性，其中的香叶醛和橙花醛已被证实为柠檬草精油中的抗菌活性成分[23-25]。而本研究提取的柠檬草叶片和根茎中橙花醛和香叶醛的含量分别高达 51.41%和16.37%。这为柠檬草精油的提取以及在抑菌方面的开发利用提供了很好的理论依据。

3 结论

本研究通过采用自制微型底聚焦微波辅助无溶剂萃取装置提取柠檬草样品的挥发性成分，解决了已有方法中应用对象是富含水分的新鲜样品或者干燥样品需经过润湿等耗时的前处理问题，更加适用于从干燥的样品中提取挥发性成分。同时使用GC-MS法对柠檬草叶片和根茎萃取物中挥发性成分进行直接快速分离分析鉴定，实验结果表明柠檬草中的挥发性成分均以醛类、醇类和烯烃类物质为主，而不同部位的挥发成分存在一定差异性，同时柠檬草叶片中橙花醛和香叶醛的含量要高于其根茎中的含量，这为柠檬草精油的提取以及在抑菌方面的开发利用提供了很好的理论依据。本方法可适用于植物样品特别是固体样品的直接快速分析，具有广泛的应用前景。但本研究建立的微波辅助顶空固相微萃取GC-MS法仅是一种分离分析方法，难以收集获得挥发油，因此本方法适用于样品中挥发性组分的分离分析，不适于挥发油的制备。