光电关联显微镜技术快速定位样品台的设计及应用

戴玉洁，常 林，赵复庆

（中国科学院重庆绿色智能技术研究院，综合分析测试中心，重庆 400714）

为了深入探索物质规律，揭示科学问题的本质，科研工作中通常会结合光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）、显微拉曼光谱仪等各种仪器对材料、芯片等目标分析物进行多维度的分析，以获取更全面、准确的特征.上述仪器已经广泛的应用于各个学科的研究中，然而当前主流的技术手段对不同维度数据的分析呈现割裂状态，对于同一微区目标样品的原位联合分析仍缺乏有效手段.尤其是主流高端科学仪器处于国外垄断状态，市场成熟的联用产品通常造价较高，也无法同时实现多种科学仪器的联用.

光电关联显微镜技术（correlative light and electron microscopy，CLEM）可将样品同一区域的光学显微图像和电子显微图像联动，从而实现样品表面跨尺度（毫米尺度光学成像到微纳尺度电子成像）形貌研究，以及同一区域电子图像与光学图像的嵌合，以更全面的获取样品表面形貌特征.这种技术同时结合了光学显微镜大视野和电子显微镜高分辨大景深的技术优势，能实现诸多光学显微镜下工作仪器（如AFM、显微拉曼光谱等）的联用，因而在众多学科领域应用广泛[1-5].

拉曼光谱广泛应用于二维材料层数的表征及半导体器件及材料性能的研究.目标区域半导体材料的快速定位对于半导体器件的表征及制备有重要意义，目前工作流程仍停留在肉眼判定和大范围筛查上.研究人员在拉曼光谱下定位到目标样品后，较难在SEM、激光直写、AFM 等仪器中定位至同一位置，大大影响了样品表征的效率以及半导体器件电极的制备效率.此外，表面增强拉曼光谱（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）可以快速、无损地检测目标分析物[6]，但在实际应用中仍面临重复性差、灵敏度低等问题.常见的SERS 基底包括芯片型[7-9]、纳米颗粒溶胶[10-14]型，其中芯片型基底具有较高的一致性和稳定性，表面增强区域分布均一，但其灵敏度仍有一定限制.纳米颗粒溶胶型基底具有强烈的局域表面等离激元共振效应和密集的热点，灵敏度较高，但由于纳米颗粒溶胶的团聚过程不可控，该类型的基底稳定性和一致性较低.为实现高性能的SERS 分析，纳米颗粒溶胶在基底设计中不可或缺，但如何提升其稳定性和一致性，以及如何选取合适的区域进行SERS 检测至关重要.对于该区域的光学图像、电子图像、元素分布图像的原位嵌合以及跨尺度形貌表征是探明其增强机制和优化基底设计策略的前提.

为此，本文开发了分区带标记的光学标尺及配套定制样品台，将其坐标与电子显微镜坐标相对应，通过扫描电子显微镜-能谱仪大面积拼接功能获得样品不同区域元素分布情况，实现了大面积电子图像及能谱图像的拼接及与光学图像的同步，从而实现SERS 基底目标区域的多维度、跨尺度信息获取，为相关机制研究提供有力支撑.

1 材料与方法

1.1 仪器和材料

定制样品台、标尺制备所需仪器与材料：石英玻璃（定制，4 cm ×4 cm ×2 mm）；CNC 定制铝合金（6061 型）；S1805 光刻胶（Microchem，美国）；显影液（Microchem，美国）；匀胶机（EZ4，江苏雷博，中国）；激光直写机（DWL 66Fs，Heidelberg，德国）；溅射镀膜机（DP650，Alliance concept，法国）；异丙醇（百灵威，中国）；丙酮（科隆试剂，中国）.分析测试设备包括：场发射扫描电子显微镜（JSM-7800F，JEOL，日本），光学显微镜（Primostar1，Zeiss，德国），高拍仪（GP1500AF，广州科密，中国），原子力显微镜（Dimension EDGE，Bruker，德国），激光共聚焦拉曼光谱仪（InVia Reflex，Renishaw，英国）.试验所用试剂均为分析纯，没有进一步纯化处理，去离子水由实验室纯水机制得.

1.2 CLEM 定位样品台的设计与制作

1.2.1 样品台的设计与制作

本文定制的CLEM 样品台分为上下两个部分，其设计如图1（a）（c）所示，下方红色部分为样品台底座，上方灰色部分为标尺边框，其中下方红色部分主要起样品承载作用以及与SEM 标准样品台的固定连接，上方灰色部分为镂空框架，用以搭载定位标尺，上下两部分通过卡扣结合.使用50 mm×50 mm× 5 mm 的铝合金板，通过数控车床CNC 按设计图纸进行切割加工，得到试验所需定制样品台，如图1（b）所示.

图1 定制样品台（a）（c）设计图及（b）实物图Fig. 1 (a) (c) Design drawings and (b) physical drawing of customized sample stage

1.2.2 定位标尺的制作

选择2 mm 厚的透明石英片作为定位标尺的基底，通过微纳加工的方式在石英片的一面标记坐标，具体加工流程如图2（a）所示.

图2 （a）标尺加工流程图，（b）标尺实物图Fig. 2 (a) Flow chart of ruler processing, (b) physical drawing of ruler

首先，在石英片上旋涂一层S1805 光刻胶并进行前烘程序，使用激光直写机将预先设计好的标尺图形曝光到涂有光刻胶的石英片上，之后对曝光的基片进行显影处理，并用N2枪吹干.显影后的基片采用溅射镀膜仪先后进行Cr 20 nm 及Au 100 nm溅射，之后用丙酮超声清洗5 min 剥离剩余光刻胶.最后以异丙醇、去离子水分别清洗石英片并用N2枪吹干，即可获得覆有坐标的标尺，如图2（b）所示.其中标尺的尺寸为4 cm × 4 cm，每个微区大小为2 mm ×2 mm，每个微区分别以字母A 至T 代表行数，以数字1 至20 代表列数进行标记.

1.3 CLEM 样品台的快速定位分析流程

使用CLEM 标尺进行定位时，首先采用标尺上的微区对目标区域进行粗定位，之后以目视判断的方法对微区内的光学特征与电子显微特征进行对照，以实现原位图像嵌合.具体流程如图3（a）所示：

图3 CLEM 样品台用于快速定位分析Fig. 3 Correlative light and electron microscopy sample stage for rapid localization analysis

（1）将负载有目标分析物（实验室制备的WS2[15]）的硅片用碳导电胶带固定在定制的样品台底座上，并将定制样品台用导电胶带固定到SEM 标准样品台上.

（2）将带有标尺的石英片覆盖在上述第一步固定有目标分析物的定制样品台中，并用高拍仪从俯视视角拍摄样品台（从上至下包含样品台标尺，硅片，样品台底座和SEM 标准样品台）.

（3）将上述高拍仪拍摄的图像导入能谱仪软件AZtec，然后去掉带标尺的石英片，将第一步固定好的样品送入SEM 样品仓内.

（4）利用第三步导入的样品图像，使用能谱仪软件AZtec 图像配准功能，实现能谱仪软件控制样品台定位和导航.在SEM 观察模式下进行微区形貌分析，确定目标分析位点，并拍摄相应的SEM 形貌图[如图3（b）所示].此时，在能谱仪软件AZtec 图像配准模式下读出该处目标区域标尺坐标.

（5）将第一步固定好样品的定制样品台取下，根据样品表征需要放入拉曼光谱仪、光学显微镜和AFM，根据第四步所得标尺坐标值，分别快速定位至检测区域，在目标区域进行拉曼检测[图3（c）]、光学图像拍摄[图3（d）]、AFM 表征[图3（e）]，获得相应表征数据.

2 结果与讨论

2.1 利用CLEM 样品台表征二维材料

按照1.3 项下的快速定位分析流程表征实验室制备的WS2二维材料.图4 为同一WS2样品点在光学显微镜、SEM、拉曼光谱、AFM 下获得的材料信息.使用CLEM 样品台快速定位后，能够实现样品的粗定位和导航，在进行SEM 拍摄时，其对应区域的图像信息可与光学显微镜图像进行对照，实现原位图像嵌合.如图4（a）所示，WS2片层结构粗定位于标尺A1 区域，其对应的光学图像如图4（a1）（a2）所示.根据其粗定位坐标可快速在SEM 中定位单个WS2材料的位置，对应的SEM 图像如图4（a3）（a4）所示，对照光学和对应的SEM 图像确定嵌合，其嵌套精度可达微米尺度.同时利用光学导航定位，实现了相同位置拉曼光谱仪中单个WS2材料的快速定位与mapping 分析，如图4（b）所示，其特征结构与光学显微图像及SEM 图像吻合，证实所制备的快速定位样品台的优越性.并且利用该样品台快速定位至单个WS2材料对其成分[图4（c）]及层厚进行分析[图4（d）].表明所设计的CLEM 样品台可实现快速定位，并联合高分辨电子显微图像、AFM、拉曼光谱对同一位置、同一WS2样品点实现成分、形貌、厚度等多种信息的原位表征.

图4 （a1）（a2）A1 区域左侧WS2 样品光学显微图像及（a3）（a4）电子显微图像，（b）同一位置的拉曼mapping 图，（c）WS2样品拉曼谱图，（d）WS2 样品AFM 厚度测定Fig. 4 (a1) (a2) Optical microscopy images and (a3) (a4) electron microscopy images of WS2 at left of region A1, (b) Raman mapping results of same location, (c) Raman spectrum of WS2, (d) AFM image of WS2

2.2 利用CLEM 样品台解析双咖啡环增强机制

本课题组已通过耦合金纳米棒和陷光结构石英片，制备了一种基于双咖啡环效应的新型基底，所制备的新型基底为疏水陷光结构.陷光结构由刻蚀石英片后形成，呈凹凸结构，阵列排布，该结构能保护金纳米棒不被解吸并提高基底稳定性（如图5所示）.金纳米棒与陷光结构组装后，聚集在陷光结构凹面上.陷光结构还进行了疏水化处理，避免下一个液滴与金纳米棒接触[16].不同于传统SERS 基底，该基底能够实现高灵敏、高一致性检测的区域仅位于双咖啡环交叉处.在试验过程中，需要反复定位同一位置咖啡环，并对其进行分析，利用现有的光学显微镜及SEM 很难实现定位嵌合，但所设计的CLEM 样品台可以在不同分析仪器（如SEM、SERS 等）间实现同一位置咖啡环的重复定位.通过能谱大面积拼接元素分布分析验证了目标分析物以及金纳米颗粒溶胶在咖啡环上的富集，联合拉曼光谱技术验证了基于双咖啡环效应下SERS 检测性能的提升.通过高分辨扫描电子图像进一步揭示了双咖啡环效应的底层原理，最终实现了三苯基锡的快速检测.

图5 陷光结构微观形貌[16]Fig. 5 SEM of light-confining structures[16]

使用定制的CLEM 样品台以及大面积拼接能谱功能对单、双咖啡环区域进行大面积成像[图6（a）]和元素分布[图6（b）（c）]分析，证实了金纳米棒在第一咖啡环形成时同步组装在陷光结构的内部，金纳米棒在咖啡环效应的作用下大部分分布到液滴边沿，在毛细力作用下进行组装，该结果由能谱大面积拼接决定[图6（c）].目标分析物三苯基锡在第二咖啡环形成时，在其与第一咖啡环交叉处与金纳米棒充分混合、吸附，待液滴完全挥发后，待测物完全吸附在金纳米棒的表面，形成共混的自组装体系，使待测物充分的分布在热点区域，目标分析物的分布由能谱大面积拼接决定[图6（b）].由于咖啡环效应，该体系位于陷光结构的作用区域内，在陷光效应下其电场强度得到进一步的增强，提高了SERS检测的稳定性和一致性，并且在咖啡环效应和超疏水的双重作用下，纳米溶胶和待测物三苯基锡均会在咖啡环上充分富集，进一步提高基底的灵敏度.

图6 （a）双咖啡环的大面积拼接扫描电子图像，（b）双咖啡环中第二咖啡环的分析物分布，（c）双咖啡环中第一咖啡环的金纳米颗粒分布，（d）陷光结构耦合双咖啡环基底与单独陷光结构及纳米颗粒基底的性能对比，（e）三苯基锡SERS 梯度检测[16]Fig. 6 (a) Large area SEM image of inter coffee ring, (b) analyte distribution of second coffee ring, (c) gold nanorods distribution of first coffee ring, (d) SERS performance comparison of different structures, (e) triphenyltin SERS assay[16]

使用定制的CLEM 样品台对比了目标分析物在陷光结构内、目标分析物与金纳米颗粒混合滴加在硅片上，以及双咖啡环效应下的基底SERS 性能[图6（d）]，结果表明双咖啡环效应下的SERS 性能大幅提升.通过CLEM 联用手段在显微拉曼光谱仪下对目标检测区域快速定位，最终实现了高灵敏度、高一致性的三苯基锡检测，检测下限达到10-12mol/L[图6（e）].

3 结论与展望

本研究设计制作了一种通过光学导航、目视粗定位以及显微图像定位结合的样品台及配套标尺.快速实现了SEM 与光学显微镜及其他具有显微光学系统的仪器（AFM、显微拉曼光谱仪）联用，大大增强了仪器联用程度以及平台的样品原位数据分析能力.成功实现了二维材料SEM、拉曼以及AFM 联合表征，联合拉曼、SEM 以及大面积拼接功能，解析了SERS 基底的增强机制.该样品台及标尺广泛兼容了材料制备、分析过程中需使用到的多数仪器，大大提升了相关学科数据获取能力，对其科研工作具有重要意义.由于当前样品台的定位仍然需要目视嵌合，无法实现自动化微纳米尺度的套准，未来还可搭载电动位移台、电驱系统以及与各仪器厂商的样品台适配等，集成原位拉伸、原位电化学等系统，以实现更为全面的样品分析.