微波辅助提取紫甘蓝中花青素工艺优化的研究

李艳秋，刘宇欣，李红利

（1.漯河职业技术学院食品学院，河南漯河 462002；2.河南工业大学漯河工学院，河南漯河 462002；3.河南工业大学粮油食品学院，河南郑州 450001）

紫甘蓝也叫红甘蓝，俗称紫包菜，是芸苔属十字花科中的一个植物。甘蓝是欧洲地中海海岸的一种蔬菜[1]，栽培史长达数十年。紫甘蓝进入中国的时间相对较短，只有100 余年的历史。紫甘蓝营养价值较高，含有B 族维生素、叶酸、维C、维E、纤维素等。此外，紫甘蓝中还含有丰富的花青素，花青素是一种在水中溶解性较大的细胞色素[2]，主要见于花、果、叶等中，是一种生物类黄酮物质[3]，遇酸碱时会发生变化，当细胞液为酸性时花青素溶液会偏红，细胞液呈碱性则花青素溶液又变为蓝色[4]。花青素在食品着色、化妆品、染料、医药等方面应用广泛。

花青素抗氧化功能较好，是一种极好的自由基清除剂及脂质过氧化抑制剂[5]。据调查，花青素的抗氧化能力是普通抗氧化剂能力的数十倍，在医药、食品、化妆品等领域有非常重要的应用价值。大量资料显示，花青素在某些方面有抗肿瘤的效果；许多科学家也从不同的研究发现花青素对预防和治疗直肠癌、前列腺癌、胃癌、食道癌、皮肤癌等都有很好的疗效。花青素可以通过提高人体的抗氧化能力，调节血清甘氨酸甘油三酯、总胆固醇和高低密度脂蛋白等功能来达到降低血糖和血脂的作用，如紫薯花青素、葡萄花青素、菊花花青素等[6]。大量的数据显示，花青素除了具有以上作用之外，还具有保护肝脏、对睾丸的靶向作用[7]及保护视力等作用。还有报道称其具有延缓细胞衰老、增强人体免疫、抗炎、抗疲劳及抗菌等多种功能[8]，但这些作用机制至今还不清楚，有待进一步的研究。

近年来，花青素的上述多种功效引起了广大科研者的关注。花青素的提取方法主要有微波辅助提取法、超声波辅助提取法、酶辅助提取法、有机溶剂提取法、水浴提取法等。微波辅助提取法是最经济、快捷、最有价值的一种提取工艺[9]。然而，微波辅助提取法也存在一些弊端，其提取设备比较昂贵，并且所选择的溶剂也有很大的限制。栾娜等人[10]在超声辅助提取紫甘蓝中原花青素工艺的优化试验中，在提取原花青素时，超声波萃取对花青素浸出率影响最大的是料液比。超声波辅助提取法的优点是提取效率较高，提取原料范围较广泛，提取后所得杂质较少等；缺点是对提取设备要求较高，提取时间较微波比略高等。利用生物酶萃取相对来说是一种比较省事、效率高、温和且环保的提取方法[11]。采用生物酶辅助提取工艺具有条件温和、操作环境安全、对环境污染比较小、提取效果高效的特点；缺点是对温度有着较高的要求、提取成本比较高等。有机溶剂提取法是目前世界上应用最广的一种提取花青素的方法。该方法相对来说对仪器要求比较低，操作比较简单；但也有很多不足之处，其中最严重的就是大多数有机溶剂的毒副作用大，会对人体健康造成危害，并且产物提取率低。

在查阅大量文献的基础上以紫甘蓝为研究对象，利用微波法从紫甘蓝中提取花青素。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

1.1.1 试验材料

新鲜紫甘蓝，购自当地超市。

1.1.2 试验试剂

将无水乙醇配制为体积分数为60%乙醇，柠檬酸配制质量分数为10%的柠檬酸溶液。

无水乙醇500 mL，天津市富宇精细化工有限公司提供；柠檬酸500 g，天津市科密欧化学试剂有限公司提供。

1.2 仪器与设备

UV-2600 型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司产品；FA2004 型电子分析天平，上海上平仪器有限公司产品；TGL-16G 型离心机，上海安亭科学仪器厂产品；HH-8 型数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司产品；DHG-9101.1SA 型电热鼓风恒温干燥箱，上海三发科学仪器有限公司产品；EG823LA3-NR 型微波炉，佛山市顺德区美的微波电器制造有限公司产品；FW177 型高速万能粉碎机，北京市永光明医疗仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

以柠檬酸与乙醇混合溶液为提取剂，对紫甘蓝中的花青素通过微波辅助提取法进行提取，并根据吸光度来确定花青素含量，并对紫甘蓝花青素的稳定性进行了探讨。

1.3.1 预处理

将采购的新鲜紫甘蓝清洗切碎，放入60 ℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干，再打碎成粉，用60 目网筛过筛，过滤后的粉末放入密封袋内，密闭保存。

1.3.2 绘制标准曲线

（1）配制0.8%盐酸-乙醇混合溶液。在250 mL容量瓶中用移液管准确移入2 mL 的浓盐酸，用无水乙醇定容。

（2）配制标准溶液。将矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准品在10 mL 的棕色容量瓶中精确称量2 mg，用0.8%盐酸-乙醇混合溶液定容。

（3）所使用标准溶液。在10 mL 棕色容量瓶中分别移取0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL 的标准溶液，用0.8%的盐酸-乙醇溶液进行定容，最终得到的质量浓度为4，6，8，10，12 μg/mL 的溶液。

（4）测定标准曲线。取所使用标准溶液分别于比色皿中，以乙醇-盐酸混合溶液为空白，于波长520 nm 处测定其吸光度。3 组平行试验也在同一时间进行。以矢车菊-3 -O-葡萄糖苷的质量浓度为横坐标，所对应的吸光度为纵坐标，绘制了矢车菊-3-O-葡萄糖苷的标准曲线，最终得出其回归方程。标准曲线的回归方程为：Y=0.050 5X+0.034 2（R2=0.999 2）。

标准溶液的吸光度见表1，标准曲线见图1。

图1 标准曲线

表1 标准溶液的吸光度 /μg·mL-1

1.3.3 花青素的提取及含量的计算

在电子分析天平上准确称取2.000 0 g 紫甘蓝粉末于锥形瓶中，用所选择的料液比将乙醇和柠檬酸混合，然后在设定的提取时间和提取功率下进行提取。以转速4 000 r/min 离心20 min，将0.4 mL离心后的上清液置于10 mL 容量瓶中，用提取剂稀释25 倍并定容。同时，做3 组平行试验，测定其吸光度，采用公式计算了其含量。花青素含量计算公式如下：

式中：C——测定吸光度所对应的花青素质量浓度，μg/mL；

V——提取剂体积，mL；

M——所取紫甘蓝粉末的质量，g；

X——稀释倍数。

1.4 单因素试验

1.4.1 乙醇与柠檬酸体积比

在锥形瓶中分别准确称取5 份2.000 0 g 样品，再分别加入体积比为3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3 的乙醇和柠檬酸混合物，在微波功率为240 W，料液比为1∶20（g∶mL），提取时间为3 min 条件下进行提取。以转速4 000 r/min 离心20 min，在10 mL棕色容量瓶中置于0.4 mL 上清液，稀释25 倍，定容，摇晃均匀后测定吸光度，并根据上述公式计算出花青素含量，从而确定最佳体积比。

1.4.2 料液比

在锥形瓶中分别准确称取5 份2.000 0 g 样品，将料液比分别确定为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g∶mL）并固定最佳体积比，设置微波功率为240 W，提取时间为3 min 提取。以转速4 000 r/min离心20 min，在10 mL 棕色容量瓶中置于0.4 mL 上清液，使其稀释25 倍，定容，通过测量吸光度计算出花青素含量，最后得出最佳料液比。

1.4.3 提取时间

在锥形瓶中分别准确称取5 份2.000 0 g 样品，固定最佳料液比和体积比，按照微波功率为240 W，分别在微波炉中提取1，2，3，4，5 min。以转速4 000 r/min 离心20 min，在10 mL 棕色容量瓶中置于0.4 mL 上清液，使其稀释25 倍，定容，通过测量吸光度来计算出花青素含量，最后得出最佳提取时间。

1.4.4 微波提取功率

在锥形瓶中分别准确称取5 份2.000 0 g 样品，固定最佳料液比、体积比和提取时间，分别在微波炉中以80，240，400，640，800 W 的功率下提取。以转速4 000 r/min 离心20 min，收集上清液，在10 mL 容量瓶中加入0.4 mL 上清液，使其稀释25 倍，定容，通过测定吸光度计算出花青素含量，最终确定最佳微波提取功率。

1.5 正交试验设计

通过以上的单因素试验结果可知，料液比、提取功率、乙醇和柠檬酸的体积比、提取时间这4 个因素对花青素的提取率影响最大。因此，设计这4 个因素做四因素三水平正交试验。以紫甘蓝中花青素含量为参考，研究出提取紫甘蓝花青素的最佳工艺条件。当正交试验方法得出的最佳组合与极差分析结果不同时，必须进行验证试验。

正交试验因素与水平设计见表2。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 乙醇与柠檬酸体积比对紫甘蓝花青素含量的影响

乙醇与柠檬酸体积比对花青素含量的影响见图2。

图2 乙醇与柠檬酸体积比对花青素含量的影响

由图2 可知，在研究体积比这一因素时，当固定其他因素不变时，随着乙醇体积分数的不断增加和柠檬酸质量分数的不断下降，紫甘蓝中花青素含量大体保持降低。其中在二者体积比从3∶7 变为4∶6 的过程中，紫甘蓝花青素含量保持上升，在乙醇和柠檬酸体积比为4∶6 时，紫甘蓝中花青素含量达到最大。超过这一比例，花青素含量又继续降低。这是因为乙醇体积分数过高会破坏花青素结构，从而使得测得花青素含量变低。因此，选择乙醇与柠檬酸最佳体积比为4∶6。

2.1.2 料液比对紫甘蓝花青素含量的影响

料液比对花青素含量的影响见图3。

图3 料液比对花青素含量的影响

由图3 可知，在料液比这一因素中，当固定其他因素不变时，随着料液比的不断升高，紫甘蓝花青素含量持续升高，在料液比为1∶25 时，其含量最高，过此峰值后，紫甘蓝中花青素含量又在逐渐下降。这一现象产生的原因可能是随着料液比的增加，紫甘蓝中的其他杂质也随之增多，从而使得所提取出来的花青素含量降低，在料液比为1∶25 时，花青素含量最多。因此，选择1∶25 为最佳料液比。

2.1.3 提取时间对紫甘蓝花青素含量的影响

提取时间对花青素含量的影响见图章4。

由图4 可知，在选定最佳乙醇和柠檬酸体积比和料液比情况下，固定微波提取功率时，花青素提取时间越长，花青素含量先增后减。在提取3 min 时所提取出的花青素含量达到最高。其主要原因可能是由于提取时间过短时，未充分萃取花青素，而随着提取时间的继续延长，长时间加热又会破坏花青素的结构，并且对花青素的稳定性也会产生一定的损害。因此，选择3 min 为最佳提取时间。

图4 提取时间对花青素含量的影响

2.1.4 微波功率对紫甘蓝花青素含量的影响

微波功率对花青素含量的影响见图5。

图5 微波功率对花青素含量的影响

由图5 可知，在选定最佳乙醇和柠檬酸体积比、最佳提取时间、最佳料液比的前提下，在微波功率为80～240 W 时，紫甘蓝花青素含量升高，并且在240 W时，花青素含量达到最高。在之后更高的微波提取功率下，花青素含量又突然持续下降。这是因为花青素不耐热，对热非常敏感，温度升高会使花青素的结构发生变化，使花青素含量大幅度降低。因此，选择240 W为最佳微波提取功率。

2.2 正交试验结果分析

在单因素试验的基础上，进行了L9（34）正交试验。

正交试验结果见表3，方差分析见表4。

表3 正交试验结果

表4 方差分析

由表5 可知，A1B2C2D2是9 组正交试验最佳组合，即微波功率为240 W，乙醇和柠檬酸体积比为3∶7，提取时间为3 min，料液比为1∶25。对紫甘蓝花青素提取含量结果影响的主次顺序为乙醇和柠檬酸体积比（A）＞微波功率（D）＞提取时间（C）＞料液比（B）。

表5 正交结果和方差分析得到的花青素含量 /mg·g-1

由表6 可知，乙醇与柠檬酸体积比（A）、料液比（B）、提取时间（C）、微波功率（D）对紫甘蓝花青素提取结果均有极显著影响。

2.3 验证试验

正交结果和方差分析得到的花青素含量见表5。

由表7 可知，用正交试验和极差分析得出的结果是不同的，所以必须进行验证试验。以A1B2C2D2为最佳的正交试验方案，并进行3 组平行试验，再计算花青素含量，取平均值。A1B2C2D3是极差分析得出的最优组合，做3 组平行试验，取平均值。将两者所得的结果进行比较可知，极差分析得出的组合花青素含量较高，所以A1B2C2D3即料液比为1∶25，乙醇与柠檬酸体积比为3∶7，微波提取功率为400 W，提取时间为3 min 为最优提取组合。

3 结论

采用微波法，以乙醇柠檬酸混合溶液为提取剂，提取紫甘蓝中的花青素。通过单因素试验得出各个因素对紫甘蓝花青素含量的影响，在单因素的基础上又设计了正交试验。通过正交试验和极差分析得到了2 种不同的最优组合，最后又通过验证试验得出最优组合为A1B2C2D3。该方法具有操作简便、时间短、环境友好等优点。紫甘蓝花青素作为一种安全无毒的天然色素，其在食品、化妆品和医药等方面有很好的前景。相信在未来随着提取方法的不断发展，紫甘蓝花青素将会应用在更多的领域，更好地为人类服务。