延边地区一株野生羊肚菌的鉴定及其驯化栽培研究

崔林虎 孙闯 张鹏 姜立佳 赵丽

延边地区一株野生羊肚菌的鉴定及其驯化栽培研究

崔林虎 孙闯 张鹏 姜立佳 赵丽*

（延边林业科学研究院，吉林 延吉 133001）

以延边地区一株野生羊肚菌资源为研究对象，母种分离后采用分子生物学鉴定法明确其品种，并设计6个母种培养基配方、14个原种培养料配方、8个外源营养瓶配方、7个栽培基质配方，筛选其母种、原种、外源营养瓶及栽培的适宜基质。鉴定结果显示，该野生菌株“23-1”为六妹羊肚菌。配方筛选试验结果表明，“23-1”母种培养适宜PDA培养基，菌丝生长快、长势强，接种后96 h即出现菌核；原种培养料以13号配方（硬杂木屑38%、麦粒40%、麦麸10%、草炭土10%、生石灰1%、石膏1%）菌丝生长表现好，接种后15天满袋，菌丝粗壮；外源营养瓶配方中麦粒所含比例高，表现菌丝长势强、满瓶时间长，综合考虑原基形成时间及产量，适宜配方为麦粒50%～60%、硬杂木屑29%～39%、草炭土0～10%、生石灰1%；栽培基质各配方出菇时间接近，平均产量以6号配方（园土88%、珍珠岩10%、生石灰2%）显著高于其他处理，为107.46 g/筐。

延边地区；羊肚菌；驯化栽培；外源营养瓶；栽培基质

羊肚菌（spp.）隶属于子囊菌门（Ascomycota）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌属（），又名羊肚菜、羊肚蘑等，因其菌盖呈羊肚状而得名[1]。羊肚菌子实体肉质脆嫩、味道鲜美，含有丰富的蛋白质、大量人体必需氨基酸和维生素，而高含量的锌、铁以及多种矿质元素是其有别于其他药用菌的重要特征[2-3]。在我国，明代的《本草纲目》中记载羊肚菌“甘寒无毒，益肠胃，化痰利气”[4]。羊肚菌性平，味甘寒，无毒，具有益肠胃、消化助食、补脑、提神等功能，其有机锗含量较高，食用后可强身健体、预防感冒、增强人体免疫力，此外还具有抗氧化、降血脂和抗肿瘤等功效[5-7]，在国内外市场上备受欢迎。

目前，已有较多研究报道羊肚菌的种属问题[8]、营养特性问题[9]、生活史[10]、药用价值[11]等。其驯化栽培一直以来是国内外学者致力于解决的问题，至今已有130余年的历史。前期主要以野外播种、模拟自然环境出菇的仿生栽培、菌根化仿生栽培、林下仿生栽培等为主[12]。2000—2010年期间，川渝地区的羊肚菌大田栽培在“外源营养袋”技术和“易出菇品种”的支撑下逐渐成熟[13]，栽培面积逐年增加，2018—2019年栽培季面积达14 万亩（1亩≈ 667 m2），栽培区域遍布除海南之外的全国各地[14]。然而，由于羊肚菌菌种退化、连作障碍、环境条件等原因，导致每年有70%的种植者无法稳定盈利[15]，严重制约了羊肚菌产业的健康发展。

本研究以延边地区一株野生羊肚菌为研究对象，分离纯培养菌种，进行分子生物学鉴定。在此基础上，筛选其母种、原种、外源营养瓶及栽培基质的适宜配方，进行羊肚菌设施栽培，为延边地区羊肚菌科学规范栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌株：羊肚菌菌株23-1，为采自吉林省珲春市的野生羊肚菌经组织分离获得，保存于延边林业科学研究院中心实验室。

培养基：PDA、PDB培养基，购于美国BD公司（Becton，Dickinson and Company）。

主要试剂：Ezup真菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工），DNA凝胶回收试剂盒、Dream Taq-TM DNA Polymerase、DNA marker、琼脂糖等。

1.2 仪器与设备

水浴锅、电热鼓风干燥箱、医用离心机、电子天平、移液器等。

1.3 试验方法

（1）分子生物学鉴定。使用 Ezup真菌基因组DNA抽提试剂盒，依据说明书提取标本基因组DNA，对其内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）片段进行PCR扩增。PCR反应程序为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火复性30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min 4 ℃保温。将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI数据库（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST（basic local alignment search tool）比对分析。

（2）母种培养基配方筛选。设6个母种培养基配方（表1），按配方配制培养基制作培养皿，分别取直径6 mm经鉴定的羊肚菌菌株23-1的菌丝块接种于不同培养基中，20 ℃暗培养。每处理设3次重复，分别记录接种后48 h、60 h的菌落直径，并实时观察菌落形态、颜色，菌核形成时间、数量及形态等。

（3）原种培养料配方筛选。设14个原种培养料配方（表2），培养料按配方配制，装入17 cm×33 cm的聚丙烯菌种袋中，每袋装湿料1 kg，灭菌、冷却后接入菌株23-1母种，20 ℃暗培养。每处理设3次重复，统计接种后5天和15天的菌丝生长量，计算菌丝生长速度，并实时观察菌丝长势、颜色、满袋时间等。

表1 母种培养基试验配方

表2 原种培养料试验配方（%）

注：培养料含水量均为60%。

（4）外源营养瓶配方筛选。设8个外源营养瓶培养料配方（表3），每处理设3次重复。培养料按配方配制，装入200 mL玻璃瓶（直径68 mm、高度90 mm、口径50 mm）中，每瓶装料130 g，灭菌冷却后开盖，扣于已接种并暗培养10天的栽培料面上（栽培基质选择园土98%，生石灰2%），15～18 ℃暗培养，3天后开始观察营养瓶内菌丝颜色、长势、满瓶时间等，记录出现原基时间及原基密度，出菇后统计产量。

（5）羊肚菌栽培基质选择。栽培室为长4 m、宽4 m的密闭栽培室，室内配备空调、加湿器、光谱灯、温湿度表。将园土、草炭土、河沙、珍珠岩和生石灰按照表4所示配方拌制，混合均匀后装入边长42 cm、高9 cm的栽培筐内，装料厚度8 cm，表面压实，浇透水后过夜备用。将原种分成1 cm大小的菌种块，接种于料面下2 cm处，每筐接种9个点、接种60 g。接种后覆土，使筐内料面中间略高于四周，最高处不超过筐高。15 ℃暗培养10天后摆放外源营养瓶，外源营养瓶配方选择6号外源营养瓶配方（麦粒60%，硬杂木屑39%，生石灰1%），继续控制温度15～18 ℃，空气相对湿度60%～70%暗培养。50天后，日间增光，滴灌催菇，降低温度至10～12 ℃，提高空气相对湿度至80%～90%，14天后可见原基产生。此时，注意通风，控制土壤相对湿度，待20天左右，羊肚菌子实体膨大，菌帽褶皱充分展开后适时采收。采收时使用经消毒的非金属刀片齐土面切断菌柄，轻放于筐内，统计羊肚菌产量。每处理设置3次重复。

表3 外源营养瓶试验配方

注：培养料含水量均为60%。

表4 栽培基质试验配方

1.4 数据测定与处理

菌丝长速使用游标卡尺测量，羊肚菌产量使用电子天平进行称量，数据均精确到小数点后两位，原始数据采用Excel软件处理，所得结果以平均值和标准差表示，利用SPSS 16.0软件对数据进行单因素方差分析，<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌株分子生物学鉴定

组织分离获得的菌株经rDNA-ITS区PCR扩增后，获得大小为642 bp的片段，通过在NCBI数据库进行BLAST搜索，发现所获片段的rDNA-ITS 区序列与GenBank中登录号为MK955410.1:56-697、MK937624.1:58-699、MK955444.1:54-695等的sp. 菌株序列的相似性均高达100%，选取相似菌株绘制进化树，可以看出它们为同一物种（图1），即菌株23-1属六妹羊肚菌。

图1 菌株23-1 PCR结果（左）和基于rDNA-ITS构建的系统发育树（右）

2.2 不同配方母种培养基的菌丝生长表现

菌株23-1在6种母种供试培养基的菌丝生长和菌核形成情况见表5，各培养基菌丝均可生长，但生长速度差异较大，其中以配方1（PDA培养基）和配方6（麦麸汁黄豆粉培养基）显著快于其他培养基，生长速度分别为1.384 mm·h-1和1.358 mm·h-1；配方2（YPD培养基）的菌丝生长速度最慢，为0.834 mm·h-1。配方1和配方5（马铃薯酵母粉培养基）菌丝浓密，长势较强。

表5 不同配方母种培养基的菌丝长速及菌核特征

注：菌核形成时间为3次重复的平均值；菌核数量“+”越多，表示菌核越多；菌丝长势“+”越多，表示菌丝长势越好；同列数据后无相同小写字母表示差异显著（＜0.05），下同。

研究认为，菌核是羊肚菌子实体形成过程的重要阶段，羊肚菌生活史以菌核为中心，菌丝形成菌核，菌核萌发再由菌丝扭结成原基，菌核形成有无与子实体是否形成存在密不可分的关系[16-17]。试验显示，配方1、配方3（PDA加富培养基）和配方5接种后96 h出现菌核，前两者颜色较深，呈棕色，后者色稍浅，呈深黄色（图2）。配方2和配方4（CYM培养基）在接种后120 h形成浅黄色菌核，且在接种点附近呈聚集状态。配方6（麦麸汁黄豆粉培养基）在接种后144 h才出现菌核，菌核密度较小，集中在培养基边缘处。

图2 不同母种培养基菌株23-1的菌丝生长及菌核形成情况

2.3 不同配方原种培养料的菌丝生长表现

羊肚菌菌株23-1在不同配方原种培养料中均能正常生长（表6、图3），菌丝生长速度以配方1为快，但菌丝细弱，发菌前期菌丝几乎观察不到，随着配方中硬杂木屑比例降低，麦粒比例提高，菌丝长速减慢，颜色渐深，趋于粗壮。菌丝生长后期，硬杂木屑比例较高的处理菌丝趋于粗壮，生长速度明显减弱，导致满袋时间有所延缓。配方13最先长满，且菌丝粗壮，接种后第5天时菌丝生长已过半，推测是因为培养料中添加了草炭土，有助于菌丝生长。

2.4 不同配方外源营养瓶原基形成与产量表现

不同配方外源营养瓶摆放后羊肚菌菌丝均正常生长（表7），满瓶时间在11～17天不等，菌丝长势存在明显差异，以1号配方100%麦粒的菌丝长势强，满瓶时间为17天；6号、8号配方菌丝满瓶快而细弱，很难观察到菌丝生长情况。不同配方在接种后68～79天可观察到原基，1号、4号、5号和6号配方可观察到的原基数量相对较多，最多超50个，但不同处理及同一处理的不同重复之间均存在较大差异。统计分析显示，6号、7号、8号3个处理之间产量无显著差异，但显著优于其他5个处理，因而认为，外源营养瓶麦粒含量宜在50%～60%范围内。

表6 供试原种培养料配方对羊肚菌菌丝生长的影响

图3 不同原种培养料配方菌丝生长情况

表7 供试外源营养瓶配方对羊肚菌原基形成及产量的影响

2.5 不同配方栽培基质原基形成与产量表现

不同配方栽培基质均能形成子实体（表8），出现原基时间较接近，但原基数量及产量差异较大，原基数量以4号、5号、6号和7号配方较多；平均产量则以6号配方显著优于其他处理，为107.46 g/筐，其次是5号和7号配方，1号配方最低，仅为53.00 g/筐。

表8 供试栽培基质配方对羊肚菌原基形成及产量的影响

3 结论与讨论

本文以延边地区野生羊肚菌菌株23-1为研究对象，母种分离后经分子生物学鉴定，确定为六妹羊肚菌，在此基础上对其母种、原种、外源营养瓶及栽培基质进行配方筛选。结果表明，菌株23-1母种在6种供试培养基中均可生长，但最适PDA培养基，菌丝生长快，长势强，接种后96 h即出现菌核。原种在不同配方培养基则表现随着硬杂木屑比例降低，麦粒比例提高，菌丝长速减慢，但颜色变深，更趋粗壮。其中13号配方（硬杂木屑38%、麦粒40%、麦麸10%、草炭土10%、生石灰1%、石膏1%）培养料在接种15天后菌丝满袋且粗壮，以其作为栽培试验的原种培养基进行下一步试验。

不同外源营养瓶摆放后均可观察到菌丝正常生长，麦粒所含比例高，菌丝长势强，但满瓶时间相对较长，综合原基形成数量及产量情况，认为麦粒含量在50%～60%较适合，即外源营养瓶适宜配方为麦粒50%～60%、硬杂木屑29%～39%、草炭土0%～10%、生石灰1%。使用不同培养基质栽培羊肚菌，各处理出现原基时间比较接近，平均产量以6号配方（园土88%、珍珠岩10%、生石灰2%）最高，为107.46 g/筐，显著优于其他处理。

研究表明，羊肚菌正常的原基形成、子实体分化及生长均需要相对较低的温度，低于15 ℃环境生长的子囊果品质较好，高于20 ℃则品质较差[4]。所以，羊肚菌栽培除菌种和技术外，最大的博弈是自然气候，尤其是温度（即冷资源）。延边地区地处吉林省东部，森林覆盖率高达80.8%，安图、敦化、珲春、汪清等多个县市均分布有野生羊肚菌资源，且近年来延边地区黑木耳、灵芝、桑黄等食药用菌产业发展迅速，2021年延边州食用菌总产量达73万吨[18]，具备发展羊肚菌产业的环境条件和技术基础。以延边地区野生羊肚菌为研究对象，探明其菌丝生长及子实体形成特性，可为延边地区发展羊肚菌产业提供技术支持。

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Identification and domestic cultivation of a wild morel () strain in Yanbian area

CUI Linhu SUN Chuang ZHANG Peng JIANG Lijia ZHAO Li*

（Yanbian Academy of Forestry, Yanji 133001, China）

In this study, A wildmorel () strain in Yanbian area as the research object, was isolated and identified by molecular biology. Six stock culture medium formulations, 14 mother spawn medium formulations, 8 exogenous nutrient bottle formulations and 7 cultivation substrate formulations were designed to screen the suitable cultivation substrate for the stock culture, mother spawn, exogenous nutrient bottle and cultivation. The identification results showed that the wild strain "23-1" was. The results of formula screening test showed that "23-1"stock culture was suitable for PDA medium, then mycelium growth is fast and strong, sclerotium appeared at 96 h after inoculation. The mycelium growth of the mother spawn medium was good in formula 13 (mixed sawdust 38%, wheat 40%, wheat bran 10%, turf soil 10%, quick lime 1%, gypsum 1%), the culture bag was full at 15 days after inoculation, and the mycelium was robust. Enhanced the proportion of wheat in the exogenous nutrient bottle formula, indicating strong mycelial growth and long filling time. Considering the formation time and yield of the primordium, the appropriate formula was wheat 50% ～ 60%, mixed wood chips 29% ～ 39%, turf soil 0 ～ 10% and quicklime 1%. The time of mushroom production is close to that of different cultivation substrate formulations, the average yield of formula 6 (garden soil 88%, perlite 10%, quicklime 2%) was significantly higher than other treatments, it is 107.46 g/ basket.

Yanbian;;domestication and cultivation；exogenous nutrient bottle; cultivation substrate

S646

A

2095-0934（2024）01-065-07

延边州科技攻关计划项目（2022NS19）；延边州科技创新中心项目（2020ZH01）

崔林虎（1983—），男，工程师，主要从事食药用菌栽培研究。E-mail：86257149@qq.com。

赵丽（1986—），女，硕士，高级工程师，主要从事食药用菌栽培育种研究。E-mail：zhaoli_19861213@163.com。