基于网络药理学和分子对接的补气通络颗粒抗心血管疾病作用机理研究

邢炎华 张建 黄壮壮， 王程 李炜 刘峰，

根据世界卫生组织的统计，全世界每年约有1 750 万人死于心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD），而这一数字到2030 年将会达到2 420 万[1]。CVD 的发病机制比较复杂，研究显示其致病因素涉及遗传、环境等诸多方面，所以单一的用药治疗方式难以取得理想效果。中药复方在预防和治疗CVD 方面具有很大的潜力[2，3]，因为其具有多靶点和多通道整体调节作用。

补气通络颗粒为证候类中药新药复方制剂，由红芪、三七、泽泻、当归、川芎、蝉蜕组成，主要治疗气虚血瘀证，具有化毒通络、补气活血的功效。该药为步长公司目前在研的治疗证候类疾病的一款新药，前期通过动物药效学试验研究，结果也表明补气通络颗粒具有补气活血，化毒通络之功效，可用于心肌缺血、脑梗死、糖尿病肾病等多种疾病中气虚血瘀证的治疗。

网络药理学融合了药理学、生物信息学、计算机等多门学科的技术和内容，系统地阐明了药物在机体中的作用机制。网络药理学重在强调系统性，与中医理论的“整体观”相一致[4，5]。临床显示中医补气活血法治疗冠心病、糖尿病、高血压等疗效较好[6]。本研究采用网络药理学探究补气通络颗粒治疗CVD 的药效成分及其作用机制，以期为证侯类中药复方的药效成分探析提供一种研究路径。

1 材料与方法

1.1 补气通络颗粒化学成分数据库建立前期利用UPLC-Q-TOF-MSE 技术对补气通络颗粒的化学成分进行定性分析，共鉴定72 个化合物。使用中药网络药理学数据库和分析平台（TCMSP）收集其化学成分，建立其成分数据库。

1.2 ADME 潜在活性成分预测利用计算机技术对补气通络颗粒成分数据库中的物质进行ADME 预测和初筛，同时利用王永华等[7]建立的obioavail 1.1和pre-Caco-2 预测模型对成分数据库中的物质口服生物利用度（OB，OB ≥30%）和Caco-2（Caco-2≥-0.40）进行计算和筛选，预测出潜在活性成分。

1.3 靶点-疾病从UniProt 数据库筛选出与CVD相关的基因信息，再通过TTD 数据库筛选出与CVD 基因信息相关的药物作用靶点，从而得到补气通络颗粒抗CVD 的靶标。

1.4 成分-靶点构建与蛋白互作（PPI）分析基于筛选的活性物质与相关靶点，利用生物信息学（Cytoscape3.6.1）软件构建成分与靶点之间的网络关系，同时利用软件相关插件对成分与靶点互作网络关系的参数（度、介数中心数）进行优化。将所筛选的靶点导入String 11.0 数据库，生物种类设为“Homo sapiens”，互作评分设置为＞0.9，其余设置默认并对游离节点进行隐藏，构建靶点PPI 网络。

1.5 KEGG 和GO 富集分析利用DAVID 在线数据库对KEGG 和GO 进行富集分析，最后筛选出补气通络颗粒抗CVD 的相关作用机制。

1.6 分子对接基于上述筛选出的关键靶点与度值靠前排名的活性物质，用分子对接软件（Sybyl-X）进行分子对接。在PDB 数据库中选择已筛选出的关键蛋白，利用Sybyl-X 中的Sulflex 模型与候选化合物进行模拟对接。选用Sybyl/Sketch 模块构建底物分子，选择Powell's 能量梯度方法进行优化，选择Tripos进行能量最小化，能量收敛设定为0.005 kcal/mol，化合物电荷类型选择Gasteiger-Hückle，最佳构象重复次数设定为1 000 次。

2 结果

2.1 ADME 潜在活性成分筛选利用pre-Caco-2和obioavail 1.1 模型按照设置条件对自建数据库中的72 个化合物进行筛选，最终获得15 个具有较好潜在活性的化合物。见表1。

表1 ADME 性质较好的化合物

2.2 靶点-疾病对筛选出的15 个化合物进行“成分-靶点”构建，去重复后得到135 个关联靶点，同时将135 个靶点和15 个化合物关联至TCMSP 数据库中，以心血管相关疾病种属为筛查目标，对上述化合物和靶点进行二次筛选，最终筛选出10 个化合物，分别为异甘草素、甘草素、芒柄花黄素、Z-藁本内酯、蛇床内酯、新蛇床内酯、丙氨酸、酪氨酸、异莪术醇、肉桂醛。并筛选出与化合物相关的26个靶点，见表2。

表2 补气通络颗粒与抗CVD 相关的26 个潜在靶点

2.3 成分-靶点构建与PPI 分析利用Cytoscape3.6.1 软件进行“成分-靶点”网络构建，网构图共有36 个节点，54 条边，黄色节点代表10 个化合物，蓝色节点代表26 个靶点，每条边代表成分与靶点之间的联系（见图1）。使用Cytoscape3.6.1 软件对“成分-靶点”网构图进行分析，以度值和介数中心度值为指标进行计算（见表3），36 个节点的平准度值为3，介数中心度值平准值为0.048，二者均值在平均值以上的确定为关键化合物和靶点，包括4 个关键化合物分别为异苷草素、芒柄花黄素、Z-藁本内脂、酪氨酸；3 个关键靶点分别为PTGS1、PTGS2、ADRB2。PPI 分析结果表明，补气通络颗粒的成分作用于多个靶点，且各靶点之间具有相互协同作用（见图2）。

图1 补气通络颗粒抗CVD 的“药效成分-靶点”网络关系图

图2 补气通络颗粒抗CVD 相关靶点PPI 图

表3 活性成分及靶点网络分析结果

2.4 KEGG 通路和GO 富集分析26 个靶点共富集于7 条与CVD 相关的通路上。KEGG 通路分析显示，补气通络颗粒抗CVD 的主要通路为Insulin signaling pathway、Calcium signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction 等（见图3）。靶点GO 富集结果显示，补气通络颗粒抗CVD 的靶点在blood circulation、circulatory system process、regulation of blood pressure 等心血管方面有明显的富集作用，靶点富集的数量分别为13、13 和10 个（见图4）。

图3 补气通络颗粒抗CVD 的KEGG 信号通路图

图4 补气通络颗粒抗CVD 的靶点GO 富集通路图

2.5 分子对接3 个关键靶蛋白ADRB2（PDB ID：3NYA）、PTGS1（PDB ID：6Y3C）和PT-GS2（PDB ID：5IKQ）与度值排名前三的化合物酪氨酸、异甘草素和芒柄花黄素分子对接结果显示，ADRB2 与酪氨酸对接的打分值为5.4932，PTGS1 与异甘草素的打分值为5.1074，PTGS2 与芒柄花黄素的打分值为4.1662，结果表明关键靶蛋白和对应的化合物对接良好，这与网络药理学筛选的实验结果一致，进一步验证了网络药理学筛选的结果准确性。其中ADRB2 和酪氨酸对接打分值最高，表明其对接效果最好。三组对接实验获得靶蛋白与分子相互结合的活性位点见图5，其中黄色线条为氢键作用力，是靶蛋白与活性分子相结合的主要作用力。

图5 补气通络颗粒抗CVD 的关键靶点和关键活性成分的分子对接图

3 讨论

随着对药物研发要求的不断提升，单靶点高选择性的研发思路具有一定的局限性。网络药理学融合了多学科的技术和内容，利用系统观和整体观的思想，采用多靶点研究思路进行药物的设计、筛选，为新药研究提供了一种新方法，以达到增效减毒功效。由于疾病、药物在生物信息相互关联方面的复杂性，同时针对这一网络研究缺少特异性，因此通过网络模块或子网络将这一复杂网络进行解构和降维，再将网络模块和子网络作为有针对性、特异性的中药靶点进行网络互作分析。利用多靶点进行网络互作分析的方法在研究中药配伍、减毒增效等方面将发挥更大作用[8]。

本研究网络构建与分析的关键化学物质中，异甘草素、芒柄花黄素、酪氨酸3 个化合物的度值大于10 并且远高于其他化合物。异甘草素属于异黄酮类物质，是甘草中主要药效成分之一。李德芳等[9]综述了异甘草素的药理作用，发现异甘草素具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎作用，并对心血管系统有较好的保护作用。任欢欢等[10]采用Langendorff 建立离体心脏灌流模型的方法，发现异甘草素对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。芒柄花黄素也是一种异黄酮类化合物，广泛存在于黄芪、甘草及葛根等豆科植物中，王健等[11]综述了芒柄花黄素的现代研究进展，药理研究表明该化合物具有抗肿瘤、降血脂、抗心律不齐、改善动脉粥样硬化以及抑制血管平滑肌增殖等作用。王建康等[12]发现人体血清游离酪氨酸等氨基酸及血管内皮生长因子（VEGF）与冠心病关系密切，在疾病治疗过程中应注意对其进行有效地干预。网络靶标中度值位于前两位的靶点PTGS2 能与9 个化合物相关联，PTGS1 能与6 个化合物相关联。汪圣等[13]研究发现葱白可作用于MAPK8 和PTGS2 关键靶点，调控NF-κB 通路，起到抑制炎症，改善机体血脂水平，从而起到防止动脉粥样硬化作用。李杨等[14]发现活血化瘀中药可通过抑制AS 小鼠PTGS2 的产生而发挥抗动脉粥样硬化作用。Licis 等[15]发现冠状动脉疾病患者心肌梗死发病率的降低与编码PTGS1 基因中一种常见的启动子变体有明显相关性。上述关键化合物和关键靶点从文献的角度验证了补气通络颗粒抗CVD 的成分及作用机理。

补气通络颗粒中的活性成分通过作用于多个信号通路发挥抗CVD 的作用。钙信号传导通路与补气通络颗粒抗CVD 相关的靶点数量最多，有7 个，分别为ADRA1A、ADRB1、ADRB2、F2R、GRIN1、NOS2 和NOS3。Neuroactive ligand-receptor interaction 信号通路与补气通络颗粒抗CVD 相关的靶点有7 个，分别为ADRA1A、Adra2a、Adra2b、ADRB1、ADRB2、F2R、GRIN1。Insulin signaling pathway 信号通路与补气通络颗粒抗CVD 相关的靶点数量有4 个，分别为GSK3B、PDE3A、PYGM 和PTPN1。

本研究利用网络药理学对补气通络颗粒抗CVD 的药效物质进行了筛选，同时对其作用机制进行了阐述。通过网络药理学筛选共获得4 个与抗CVD 高度关联的活性成分和3 个关键靶点，应用KEGG 通路分析获得7 条抗CVD 的作用通路。本研究的结论体现了中医药理论“系统观和整体观”的思想，同时为补气通络颗粒抗CVD 药效物质筛选以及证候类中药复方药效物质筛选提供了一种新的研究思路。