基于顶空气相色谱-离子迁移谱的不同品种香稻米快速鉴别方法

卞景阳，孙兴荣*，刘琳帅，邵凯，冯鹏，车野，胡禧熙，顾鑫，徐磊，李杰

（1.黑龙江省农业科学院大庆分院，黑龙江大庆 163319；2.国家耐盐碱水稻技术创新中心东北中心，黑龙江哈尔滨 163316）

水稻是世界上主要的粮食之一，黑龙江省水稻产量占全国水稻产量的近五分之一[1]。目前，人们不仅仅满足于食品的营养与安全，更对食品的风味有更高的要求[2-3]。香气是食品最重要的风味特征之一，是决定食品是否被消费者所接受的关键因素。香稻米深受消费者喜爱，具有浓郁的香味，多种微量元素含量高，是一种高营养价值的稻米[4]。香味是香稻米品种最重要的品质性状之一，因此探究不同香稻米品种中挥发性风味物质，可实现对不同品种香稻米的品质评价，对香稻米的育种和开发具有重要的意义。

目前，许多分析技术已被开发用于评价不同样品的挥发性成分以及样品的鉴定分析。然而，这些传统方法的样品前处理的提取过程耗时较长，无法实现样品的快速分析，如高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色谱-质谱（liquid chromatograph-mass spectromete，LC-MS）、气相色谱-质谱（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）和超高液相色谱-串联质谱（super-high performance liquid chromatography-mass spectrum in series，UPLC-MS）。因此，亟需开发一种全新的、绿色的、无预处理的、快速、高灵敏度的光谱分析方法。气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是由气相色谱和离子迁移谱组成的一种可用于对高挥发性的有机化合物总量（volatile organic compounds，VOCs）进行评估分析和精确定量预测的超灵敏分析预测技术，具有快速分析能力。气相色谱（gas chromatography，GC）是测定挥发性物质的常用方法，离子迁移谱（ion mobility spectrumetry，IMS）是根据气体离子通过电场时不同的迁移速率来分离离子。两种方法结合时，先用GC 预分离，控制分析物的浓度，分离杂质，再用IMS 进行分离。两次分离得到的停留时间和迁移时间可以准确地确定分析物的二维特性[5-7]。相比传统的食品风味物质分析方法如电子舌、电子鼻[8-9]、气相色谱-质谱联用法、气相色谱-吸闻法、气相色谱-质谱/吸闻法[10-12]，GC-IMS 具有检测速度快、灵敏度高、操作简单、样品制备步骤简单等优点[13-14]。

目前气相色谱-离子迁移谱在风味物质分析、产品鉴别、品种溯源等领域得到了很好的应用。Zhang等[15]采用气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）和气相色谱-质谱（GC-MS）对青稞在生、洗、漂、预冷、冷冻、蒸、煮、煎加工后的挥发性物质成分进行评价，证实了通过GC-IMS 可以快速可视化和识别绿色小麦样品的挥发性成分，并根据挥发性成分的差异对样品进行明确的分类。He 等[16]利用顶空-高效气相色谱-离子迁移谱（headspace-gas chromatography-ion mobility spectroscopy，HS-GC-IMS）检测不同产地麦冬特征风味化合物，快速鉴别了浙江省三门市、慈溪市两产地的麦冬。Zhang等[17]采用气相色谱-离子迁移谱技术对黑芝麻不同加工阶段的加工产物进行鉴别。利用仪器内置的数据处理软件对样品的挥发性成分响应数据进行处理，识别不同的成分，鉴定出20 种化合物。Pu 等[18]采用气相色谱-离子迁移谱和感觉支配时间的动态感官评价方法，研究白面包在口腔加工过程中的香气释放和知觉。Yuan 等[19]建立一种基于HS-GC-IMS 的绿色、快速的百合鉴别方法，为百合不同物种的鉴别提供科学数据。Qin 等[20]采用GC-IMS 分析比较不同烟草样品香气的差异。Chen 等[21]以绍兴黄酒、山东黄酒和湖北黄酒为研究对象，对其挥发性风味成分进行鉴别。

本研究利用GC-IMS 技术，检测香稻米品种“牡育稻78 号”、“牡科稻5 号”、“牡科稻7 号”3 种稻米中的挥发性风味成分，通过比较“牡育稻78 号”、“牡科稻5 号”、“牡科稻7 号”样品挥发性风味物质指纹图谱，对试验所选牡丹江地区3 个不同品种稻米进行区分，以期为不同品种稻米品种区分、品质评价、品种选育提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

稻米：“牡育稻78 号”（MD1）、“牡科稻5 号”（MD2）、“牡科稻7 号”（MD3）：由黑龙江省农业科学院牡丹江分院优质水稻种植推广示范稻基地；Flavour-Spec®风味分析仪：德国G.A.S 公司；MXT-5 色谱柱（15 m×0.53 mm）：美国RESTEK 公司；外标正酮C4～C9：国药化学试剂北京有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理

称取“牡育稻78 号”（MD1）、“牡科稻5 号”（MD2）、“牡科稻7 号”（MD3）稻米样品各2 g 于进样瓶中孵育后进样。

1.2.2 GC-IMS 检测条件

表1 GC-IMS 检测条件Table 1 GC-IMS detection conditions

1.3 数据处理

采用仪器配套的分析软件对IMS 数据进行化学计量分析。通过LAV 软件处理IMS 数据，计算挥发性化合物的保留指数（retention index，RI），利用Reporter、Gallery Plot 内置插件进行谱图分析。Reporter生成了称为地形图的光谱，它可以通过二维俯视图和三维光谱直接比较样品之间的光谱差异；Gallery Plot比较不同样品之间的VOCs 差异，通过所选VOCs 的峰值强度来比较不同样品中VOCs 的含量；利用GCIMS Library 检索软件对物质进行定性分析。采用SIMCA 14.1 软件进行PCA 分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种香稻米气相色谱-离子迁移谱图（GCIMS）和谱图对比分析

采用GC-IMS 对来自牡丹江地区的3 个不同品种的香稻米挥发性成分进行分析，结果如图1～图3所示。

图1 不同品种香稻米中挥发性物质的GC-IMS 三维谱图Fig.1 Three-dimensional GC-IMS of volatile components in different varieties of fragrant rice

由图1 可知，3 种不同品种的香稻米品种GC-IMS三维谱图非常近似，难以直接通过挥发性成分进行品种区分，但挥发性物质含量存在一定的变化，物质峰的信号强度在“牡育稻78 号”、“牡科稻5 号”、“牡科稻7号”3 种不同品种香稻米中有所不同。

为了对“牡育稻78 号”、“牡科稻5 号”、“牡科稻7号”3 种不同稻米中挥发性成分进行区分，对反应峰的离子迁移时间和位置进行归一化处理，得到如图2所示的GC-IMS 的二维俯视谱图，其中x轴为离子相对迁移时间，y轴为气相色谱的保留时间。由图2 可知，谱图中显示了“牡育稻78 号”、“牡科稻5 号”、“牡科稻7 号”3 种香稻米中的总挥发性化合物，挥发性化合物的信号峰均出现在迁移时间1.0～2.0 s 和保留时间100～800 s 的范围内。信号强度用不同颜色表示，物质含量低呈现白色，物质浓度高呈现红色[22-23]。通过GCIMS 技术“牡育稻78 号”、“牡科稻5 号”、“牡科稻7号”3 种不同品种香稻米中挥发性物质可实现较好地分离，为了能够进一步比较分析出样品特征间可能的差异，通过差异对比分析模式，对“牡育稻78 号”、“牡科稻5 号”、“牡科稻7 号”进行分析，如图3所示。选取“牡育稻78 号”作为参比，其它样品扣除参比，颜色变浅，代表其挥发性物质浓度低于其参比，颜色变深代表其挥发性物质含量高于其参比（如白色、红色、蓝色等分别代表其挥发性物质一致、挥发性物质高于参比、挥发性物质低于参比）。

图2 不同品种香稻米中挥发性物质的GC-IMS 二维谱图（俯视图）Fig.2 Two-dimensional GC-IMS of volatile components in different varieties of fragrant rice（vertical view）

图3 不同品种香稻米中挥发性物质的GC-IMS 二维谱图（差异对比图）Fig.3 Two-dimensional GC-IMS of volatile components in different varieties of fragrant rice（difference contrast）

2.2 不同品种香稻米GC-IMS 挥发性风味成分定性分析

“牡育稻78 号”、“牡科稻5 号”、“牡科稻7 号”3 种香稻米挥发性化合物定性谱图如图4所示（以“牡育稻78 号”为例），每种挥发性成分在图中显示为标记点。通过与正酮C4～C9 标准品比较，计算“牡育稻78 号”、“牡科稻5 号”、“牡科稻7 号”中挥发性物质的保留指数[24-26]，结果如表2所示。

图4 香稻米挥发性成分离子迁移谱定性分析Fig.4 IMS qualitative analysis of volatile components in different varieties of fragrant rice

表2 香稻米中挥发性物质分析Table 2 Analysis of volatile components in fragrant rice

由图4 和表2 可知，牡育稻78 号、牡科稻5 号、牡科稻7 号中含有38 种单体及二聚体物质：酮类7 种、醛类16 种、醇类9 种、呋喃1 种、醚类1 种、吡啶1 种、芳香烃2 种、单萜类1 种，其中鉴定的单体、二聚体的CAS 号相同，仅形态不同。醛类物质具有浓郁的香味；醇类化合物产生柔和的气味，这些风味物质使稻米呈现不同的风味[26-28]。

2.3 不同品种香稻米离子迁移色谱（GC-IMS）指纹谱图分析

试验选用的牡丹江地区3 种不同香稻米品种“牡育稻78 号”、“牡科稻5 号”、“牡科稻7 号”的指纹谱图如图5所示。图中横向显示牡丹江地区3 种不同品种香稻米同一样品进行3 次重复试验，纵向显示不同品种香稻米中相同挥发性风味物质[29]。

图5 不同品种香稻米中挥发性物质的指纹谱图Fig.5 Fingerprint spectrum of volatile components in different varieties of fragrant rice

由图5 可知，3 种不同品种的香稻米挥发性风味物质丰富，通过数据库比对确定了38 种风味物质，不同品种香稻米中挥发性物质有明显的不同之处。红色区域框内，挥发性风味物质在“牡育稻78 号”中最丰富，其次为“牡科稻5 号”，“牡科稻7 号”中最少，主要为化合物罗勒烯、柠檬烯单体、柠檬烯二聚体。绿色区域框内挥发性物质如乙醇、二甲基-1-丁醇，在“牡科稻7 号”中最多，其次为“牡科稻5 号”，“牡育稻78 号中”最少。黄色区域框内挥发性物质如2-甲基-2-丙醇、2-甲基丁酮、2-正戊基呋喃、2-己烯醛单体、（E）-2-庚烯醛二聚体、2-己烯醛二聚体，苯乙醛、2-己烯醛单体、在“牡育稻78 号”中最丰富，其次为“牡科稻7 号”，“牡科稻5 号”中最少。紫色区域框内物质如辛6-甲基-5-庚烯-2-酮、辛醛单体、辛醛二聚体，在“牡科稻5 号”中含量最少，在其它样品中差异不大。

2.4 不同品种香稻米特征风味物质的相似度分析

采用主成分分析法对GC-IMS 数据降维，区分“牡育稻78 号”、“牡科稻5 号”、“牡科稻7 号”中挥发性物质特征，显示数据结构。主成分分析用于将一组原始相关变量转化为几个独立的不相关变量，这些不相关变量能够解释原始变量的大部分变化。本研究将牡丹江地区3 种不同品种的香稻米的GC-IMS 谱图风味成分数据进行主成分分析，结果如图6A所示。采用仪器软件计算试验中牡丹江地区“牡育稻78 号”、“牡科稻5 号”、“牡科稻7 号”不同品种稻米样本之间的欧几里得距离，欧氏距离图如图6B所示，通过检索最小距离确定样品间的相似程度[30]。

图6 不同品种香稻米挥发性风味物质相似度分析Fig.6 Similarity analysis of volatile flavor components in different varieties of fragrant rice

由图6A 可知，主成分PC1 贡献率为63%，PC2 的贡献率为21%，累计贡献率达到84%，能够较好代表和解释原始数据的大部分特征，3 个样品能够有效的分开。PC1、PC2 的总贡献率包含了不同品种香稻米样品的大部分信息，能代表不同品种香稻米挥发性风味的主要特征。“牡科稻5 号”和“牡育稻78 号”距离最远，表明这两种香稻米的风味存在较大差异，“牡科稻5 号”、“牡育稻78 号”与“牡科稻7 号”距离较近，表明稻米间的风味差异较小。本研究采用GC-IMS 较好地区分不同品种的香稻米。由图6B 可知，“牡育稻78号”、“牡科稻7 号”之间距离最近，相似度高，虽然，“牡育稻78 号”检测平行样品出现一个异常值，但整体结果与PCA 结果一样，因此可以通过欧式距离直接对不同品种香稻米进行区分。

3 结论

采用GC-IMS 可以较好地鉴别牡丹江地区“牡科稻5 号”、“牡育稻78 号”与“牡科稻7 号”3 种不同的香稻米品种。研究发现：香稻米中的挥发性物质主要包括酮类7 种、醛类16 种、醇类9 种、呋喃1 种、醚类1 种、吡啶1 种、芳香烃2 种、单萜类1 种。本研究利用GC-IMS 技术检测香稻米香气成分，通过对“牡育稻78 号”、“牡科稻5 号”、“牡科稻7 号”、3 种不同品种的香稻米香气成分的分析和比较，确定了特征香气成分及其特征峰，如辛醛单体、辛醛二聚体、6-甲基-5-庚烯-2-酮，在“牡科稻5 号”中含量最少，在其它样品中差异不大。罗勒烯、柠檬烯单体、柠檬烯二聚体在“牡育稻78 号”中含量多；乙醇、二甲基-1-丁醇，在“牡科稻7号”中最多。通过主成分分析和欧氏距离分析表明，“牡科稻5 号”、“牡育稻78 号”与“牡科稻7 号”3 种不同香稻米可通过GC-IMS 谱图数据实现区分。