广西地区耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的流行特征、耐消毒剂基因检测及同源性分析

梁 琼,李素艳△,蒙华莹,唐 娟,覃卫娟,李春燕

广西医科大学第二附属医院:1.医院感染管理科;2.医学检验科;3.遗传与基因组医学研究中心,广西南宁 530000

铜绿假单胞菌(PA)属于非发酵革兰阴性杆菌,广泛分布于人体皮肤、呼吸道和肠道、医院各类物体表面,为医院感染主要的条件致病菌之一,其感染可发生在人体任何部位和组织,其中呼吸道是其主要感染部位[1]。近年来,随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛应用,耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(CRPA)的检出率不断上升[2-3],给临床抗感染治疗带来了严峻挑战。多重耐药菌的感染与住院患者的病死率密切相关,已成为医院感染防控工作的重点。对医疗环境及器械的合理消毒是高效、简易的切断多重耐药菌传播途径策略。但是随着各种消毒剂的广泛使用或不恰当使用,出现了越来越多的消毒剂耐药菌株[4-5],增加了院内感染控制的难度。不同地区PA的耐药性及对消毒剂的抗性均可能存在差异[6-7]。目前,鲜有针对广西地区细菌耐消毒剂基因检测和菌株同源性分析的研究。为了解医院CRPA流行特征及耐消毒剂基因携带情况,本研究对2020—2022年本院临床分离的CRPA的耐药性、耐消毒剂基因的携带情况及同源性进行研究,旨在为临床抗菌药物的使用及院内感染控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集本院2020—2022年临床科室送检的住院患者分离培养的CRPA,剔除同一患者相同部位分离出的同种细菌,共获得不重复菌株252株。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和PA ATCC27853。本研究获得本院医学伦理委员会批准[伦理审批号:2020第(KY-0143)号]。

1.2方法

1.2.1细菌鉴定与药敏试验 所有细菌的分离培养均按照《全国临床检验操作规程》进行,获得目的菌后,采用全自动飞行质谱检测系统(VITEK MS)进行鉴定。药敏试验采用美国BD公司Phoenix-100全自动微生物鉴定药敏分析仪及纸片琼脂扩散法进行。药敏试验结果判断和解释参照美国临床和实验室标准协会(CLSI,2019版)M100标准[8]。

1.2.2耐消毒剂基因的检测 (1)菌株复苏:将菌株冻存管从—80 ℃冰箱中取出,平衡至室温后,在管中加入2 mL营养肉汤,35 ℃培养箱中孵育过夜,将菌悬液分区划线接种至哥伦比亚血琼脂培养基上,35 ℃培养18～24 h后待用。(2)DNA模板的制备:从哥伦比亚血琼脂培养基上挑取适量典型的新鲜菌落,用一次性无菌接种环研磨溶解于含1 mL灭菌ddH2O的1.5 mL EP管中,配制成0.5麦氏浓度菌悬液,按天根细菌基因组DNA提取试剂盒说明书制备细菌DNA模板,置于—20 ℃冰箱保存、备用。(3)引物设计与合成:引物参照文献[9-10]设计,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,见表1。(4)扩增体系与条件:采用聚合酶链反应(PCR)进行扩增,2×SanTaq PCR Mix 25 μL,DNA模版2 μL,上、下游引物(100 μmol/L)各2 μL,无菌去离子水19 μL。反应条件为qacEΔ1-sul1基因95 ℃5 min,94 ℃变性20 s,58 ℃退火20 s,75 ℃延伸30 s,35个循环后,72 ℃延伸5 min;aceⅠ基因94 ℃5 min,94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,30个循环后,72 ℃延伸10 min。(5)琼脂糖凝胶电泳:取5 μL PCR扩增产物和5 μL DAN 标记物用1%琼脂糖凝胶电泳后在多功能成像仪下观察并拍照,如在基因相应大小位置出现目的条带则判为阳性,阳性产物DNA经测序证实,阴性对照为纯水。

表1 检测耐消毒剂基因的引物序列

1.2.3同源性分析 采用肠杆菌科基因间重复序列-聚合酶链反应(ERIC-PCR)对标本进行同源性分析,引物序列参考文献[11]:ERIC-PCR上游5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′,下游5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。扩增体系:2×SanTaq PCR Mix 25 μL,DNA模版5 μL,上、下游引物(100 μmol/L)各2 μL,无菌去离子水16 μL。反应条件:95 ℃预变性60 s,95 ℃变性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35个循环后,72 ℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳后在多功能成像仪下观察并拍照。电泳结果分型:图谱完全相同的为同一基因型;主条带相同,负条带相差1～2条为基因相似或密切相关;不符合上述条件者为不同基因型[11]。

1.3统计学处理 采用WHONET5.6软件和SPSS22.0软件进行数据处理及统计学分析。计数资料以例数或百分率表示,采用χ2检验进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CRPA的检出概况 2020—2022年共检出不重复的CRPA 252株,每年CRPA的检出率分别为17.23%、26.51%、24.62%,平均检出率为22.79%。分离出CRPA最多的标本是痰液标本(63.49%),其次为肺泡灌洗液标本(17.06%);主要来源于综合重症监护病房(ICU)和其他ICU(40.87%),来自非ICU病区的占比为59.13%,非ICU病区主要分布在康复医学科(14.68%)和呼吸科(12.70%)。CRPA在ICU和非ICU病区内的检出率(包括重复检出菌)分别为41.09(159/387)和16.82%(208/1 237),CRPA在ICU的检出率明显高于非ICU病区的检出率,差异有统计学意义(P<0.001)。ICU及非ICU病区CRPA不同标本来源比例比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 CRPA标本来源分布[n(%)]

2.2CRPA药敏试验结果

2.2.1不同年度CRPA耐药率 除头孢吡肟、头孢他啶/阿维巴坦、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、多黏菌素外,CRPA对其他临床常用抗菌药物的耐药率均在30.00%以上。2020—2022年CRPA对亚胺培南、左氧氟沙星及氨曲南的耐药率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。经趋势χ2检验分析,CRPA对亚胺培南耐药率随年份变化呈线性上升趋势(P<0.05);CRPA对左氧氟沙星、氨曲南的耐药率随年份变化存在线性下降趋势(P<0.05)。见表3。

表3 2020—2022年CRPA耐药率(%)

2.2.2ICU与非ICU病区CRPA的耐药率比较 ICU病区分离出的CRPA对亚胺培南、美罗培南、氨曲南、替卡西林/克拉维酸及左氧氟沙星的耐药率基本均在50%左右或远超过50.00%。ICU与非ICU病区的CRPA对15种常用抗菌药物的耐药率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

“你看，一年不到，陆先生就瘦成现在这个样子了。”张大爷有些惋惜，“不过，李总点子多，这些日子正张罗着要把这里改建成度假酒店呢！”

表4 ICU与非ICU病区CRPA的耐药情况 比较[%(n/n)]

2.3CRPA的耐消毒剂基因检出情况 根据近几年CRPA在院内不同标本中的检出情况,确定耐消毒剂基因的检测对象选择原则:从2022年6—11月临床科室住院患者检出的CRPA中,按标本类型分布比例(痰液标本约65%,肺泡灌洗液约15%,其他标本约20%)为筛选原则留取标本,最终收集到30株非重复菌株。其中16株来自ICU病区(主要分布在综合ICU及呼吸科ICU),14株来自非ICU病区(分布于8个不同科室)。其中来自痰液标本20株,肺泡灌洗液5株,其他标本5株。共检出5株qacEΔ1-sul1基因阳性,8株aceⅠ基因阳性。2种耐消毒剂基因的表达在ICU与非ICU病区间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。qacEΔ1-sul1基因阳性菌株80%来自呼吸道标本,其在不同类型标本中检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05);aceⅠ基因阳性菌株75%来自呼吸道标本,其在不同类型标本中检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 不同科室及整体耐消毒剂基因检出率[n(%)]

2.4qacEΔ1-sul1基因阳性和阴性菌株的耐药率 qacEΔ1-sul1基因阳性菌株对头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶/阿维巴坦、环丙沙星、阿米卡星、庆大霉素及妥布霉素耐药率均高于qacEΔ1-sul1基因阴性菌株,差异有统计学意义(P<0.05),对其他抗菌药物的耐药率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 qacEΔ1-sul1基因阳性和阴性菌株的耐药率 比较[n(%)]

2.5ERIC-PCR基因分型结果及菌株同源性分析 30株CRPA经ERIC-PCR基因分型,电泳条带长度为100～2 000 bp,根据电泳图谱差异进行同源性分析,30株菌株被分为A、B、C、D、E、F、G、H 8个型别。其中A型13株,B型7株,D型4株,E型2株,C型、F型、G型及H型各为1株。A型和B型为主要的流行株,在多个主要科室如呼吸科ICU、胸心血管外科、综合ICU、神经外科及康复医学科均有分布。13株A型标本中,9、18号标本在综合ICU住院时间上有交叉,17、28、65、74号标本在呼吸科ICU住院时间上有交叉,16、37号标本在康复医学科住院时间上有交叉,58、62号标本在神经外科住院时间上有交叉。综合ICU病区分离的菌株存在多种(6种)基因型。呼吸科ICU病区有A(4株)、B(2株)、C(1株)3种基因型。

3 讨 论

PA在自然界中广泛存在,是医院感染常见的革兰阴性条件致病菌之一,也是医院获得性肺炎患者的主要感染病原菌。全国细菌耐药监测网数据显示,2014—2019年PA检出率每年均居临床标本分离的革兰阴性菌前5名,且主要来源于呼吸道标本[12-13]。陶春梅等[6]对重庆某院的研究,吴振安等[14]对北京某院的研究均显示PA主要来源于呼吸道标本。本研究的数据与以上研究结果相吻合,从标本来源和科室分布来看,CRPA主要来源于呼吸道标本(80.6%),康复医学科、呼吸科和ICU病区分离率较高,说明CRPA多来源于肺部感染的内科患者,因此,该群体应该成为PA感染防控的重点目标人群。2021、2022年CRPA的检出率分别为26.51%、24.62%,高于全国同等级医院CRPA的检出率(18.8%～21.4%)[12]。本研究中CRPA对亚胺培南耐药率随年份变化呈上升趋势。YU等[15]的研究发现,亚胺培南耐药-头孢他啶敏感的PA耐药机制为外排泵基因(mexB、mexD、mexF和mexY)的过度表达及Oprd表达降低,而非碳青霉烯酶的作用,CRPA对头孢他啶的耐药率为34.26%,对亚胺培南的耐药率高达92.86%,提示本研究中CRPA的作用机制可能为外排泵基因(mexB、mexD、mexF和mexY)的过度表达及Oprd表达降低。因此,头孢他啶仍是治疗CRPA的重要选择。

本研究中的CRPA对氨基糖苷类抗菌药物的耐药率较低(均低于20.00%),对第3代、第4代头孢类抗菌药物的耐药率分别为34.26%、26.03%,低于浙江省朱建铭等[16]报道的CRPA对氨基糖苷类抗菌药物的[头孢他啶(76.53%)、头孢吡肟(60.20%)]耐药率,低于南京地区尹娟等[17]报道的CRPA对阿米卡星(30.60%)、庆大霉素(57.14%)、头孢他啶(59.18%)、头孢吡肟(83.6%)的耐药率,可能与各医院的临床用药习惯不同有关。

本研究结果显示,ICU分离出的CRPA对亚胺培南、美罗培南、氨曲南、替卡西林/克拉维酸及左氧氟沙星的耐药率在50.00%左右或远超过50.00%。CRPA在ICU及非ICU病区内的耐药率比较,差异无统计学意义(P>0.05),与既往报道的PA在ICU内的耐药率明显高于非ICU的结果不一致[18]。

2020—2022年正是全球新型冠状病毒感染疫情大流行阶段,消毒剂的使用量激增,消毒剂不合理使用及耐药问题越来越突出。细菌通过生物膜的形成、外排泵的表达、染色体或质粒介导等一系列机制抵抗消毒剂的作用[19]。目前研究较多的是由质粒介导的qac基因家族,细菌获得qac基因家族后表达多种化合物外排泵。多项研究表明,qacEΔ1-sul1基因在各类革兰阴性菌中广泛存在,qacEΔ1-sul1基因的携带可使细菌对临床常规消毒剂抗性增加,导致医院消毒的失败及院内感染的发生[7,20]。本研究中qacEΔ1-sul1基因检出率为16.67%,远低于邓晶荣等[7]研究的60%。ICU病区来源的标本qacEΔ1-sul1基因的检出率为18.75%,同样低于张福华等[10]研究中40.95%。有研究结果显示,携带qacEΔ1-sul1耐消毒剂基因可使某些抗菌药物的耐药性和消毒剂最低抑菌浓度(MIC)值均升高[21]。本研究中qacEΔ1-sul1基因阳性菌株对头孢类、氨基糖苷类及多数含酶抑制剂类抗菌药物的耐药率均高于qacEΔ1-sul1基因阴性菌株,差异有统计学意义(P<0.05),提示抗菌药物和消毒剂可能存在交叉耐药现象,这可能是由于消毒剂与抗菌药物的化学分子结构,以及其对细菌的作用机制在某种程度上存在相同之处所致。

多项研究发现,新的外排泵家族“变形杆菌抗菌剂外排泵家族”的外排泵基因aceⅠ基因以氯己定为特异性底物[22-25]。蔺飞[9]的研究发现aceⅠ基因在鲍曼不动杆菌中携带率达100%。本研究结果显示,aceⅠ基因在CRPA中的检出率为26.67%。本研究有一定的局限性,检测标本数较少,不一定能准确反映两种基因的整体携带情况,但仍能在一定程度上反映出该类细菌对日常消毒剂的抗性。本研究对aceⅠ、qacEΔ1-sul1基因在广西地区CRPA中的分布进行了初步探索,发现aceⅠ、qacEΔ1-sul1基因均有一定的检出率,且在ICU与非ICU病区的检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05),提示院内各病区在合理规范使用抗菌药物的同时,也应关注细菌对消毒剂产生的抗性现象,降低细菌对消毒剂的抗药性,对医院环境进行综合治理。

由于PA耐药性较强,能天然抵抗多种抗菌药物和杀菌剂,容易引起暴发、流行。因此,对细菌进行基因水平的同源性分析对医院感染的流行病学调查和监测极为重要。对细菌基因分型的方法目前包括脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、随机引物PCR(RAPD-PCR)和ERIC-PCR等。目前,不少医院对细菌的分子流行病学分型仍按细菌的耐药模式进行,但实际上并不准确,不同耐药模式可能会有相同基因型别。ERIC-PCR技术具有成本低、操作简便、分辨率高和重复性较好等特点,目前应用较为普遍,适合基层医院日常进行分子流行病学监测。本研究根据标本类型比例对CRPA进行分层随机抽样,选择了2022年6—11月检出的30株非重复CRPA进行ERIC-PCR分型。其中13株为相同基因型(A型),表明这13株CRPA可能具有同源性,这13株细菌均在短期(2022年7-10月)内检出,散布于9个不同科室;经深入分析发现A型菌株在本院呈科室间流行且可能存在交叉感染,这一结果可为后续医院感染控制工作提供分子流行病学依据。

综上所述,30株CRPA中检出一定比例的aceⅠ、qacEΔ1-sul1基因阳性菌株,主要存在A、B两种优势型别的克隆流行,应严格做好各病区CRPA患者的安置、接触、隔离、预防及环境清洁消毒等措施,进而有效阻断其在病区内的交叉传播。