LncRNA XIST 和miR-101-3p 在SLE 患者外周血单核细胞中的表达及临床应用价值

赵 琳 倪成华 李 洁 梁 波 付冬冬

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种有发作趋势的慢性、系统性、自身免疫性疾病，由自身抗体或免疫因子聚集引起肾脏、心脏、血管、中枢神经系统、皮肤、肺、肌肉和关节等多个器官和组织发生损伤，具有较高的发病率和病死率，严重影响患者的生命健康［1-3］。虽然目前出现新型的生物抑制剂和更有效SLE 治疗策略，但其缓解率仍不高，造成这种状况的原因之一是缺乏高度敏感、特异的SLE 诊断方法，疾病进展检测以及治疗评价的方法。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）X 染色体失活特异转录本（X in-active specific transcription factor，XIST）是细胞生长和发育的重要调节因子，能够对细胞增殖、分化、凋亡、迁移和入侵等功能进行调节，在脑肿瘤、白血病、肺癌、乳腺癌、肺纤维化、炎症、神经性疼痛、心肌细胞肥大等多种类型肿瘤以及疾病中发挥着重要作用［4-6］。微小RNA-101-3p（microRNA-101-3p，miR-101-3p）是一种调节炎症疾病进展的重要因子，能够影响炎性细胞因子的产生和成纤维细胞样滑膜细胞的增殖，参与多种自身免疫性疾病的发展［7-8］。本研究通过检测SLE 患者外周血单核细胞中LncRNA XIST、miR-101-3p 的表达水平，探讨其与患者疾病活动性的关系，分析其对SLE 的诊断价值，以期为临床诊断SLE 提供一定的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019 年4 月至2021 年10 月在新乡市中心医院治疗的180 例SLE 患者作为观察组，同期180 例健康体检者作为对照组。根据SLE 疾病活动指数（SLE disease activity index，SLEDAI）评分，将观察组分为稳定期组80 例（SLEDAI 评分＜5 分）和活动期组100 例（SLEDAI 评分≥5 分），收集其身体质量指数等资料。两组对象性别、年龄、身体质量指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

表1 两组对象一般资料比较（）

表1 两组对象一般资料比较（）

注：SLEDAI为系统性红斑狼疮疾病活动指数。

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1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①确诊且符合SLE疾病相关诊断标准［9］者；②近期未使用甾体、激素以及免疫抑制药物治疗者；③年龄≥18 岁，自愿签署同意书者；④临床资料完整者。排除标准：①存在原发性肾炎以及其他炎症者；②有免疫功能缺陷者；③有其他结缔组织病者；④合并有肿瘤者。本研究经医院伦理委员会批准（批准号：2019211）。

1.3 方法

1.3.1 样本收集 收集所有患者入院后24 h 内（对照组为体检当日）空腹外周静脉血3～4 mL，于EDTA 抗凝管中利用Ficoll 梯度离心分离单核细胞，于-80℃冰箱中保存以备检测。

1.3.2 实时荧光定量聚合酶链（real-tim e quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）法检测外周血单核细胞中LncRNA XIST、miR-101-3p 的表达水平 根据Trizol 试剂盒（货号：SH-2366，北京凯诗源生物科技有限公司）说明书对各组样品中总RNA 进行提取，并对总RNA 浓度和纯度进行评估。按照M-MLV 反转录试剂盒（货号：PR2555，北京普非生物科技有限公司）说明进行反转录［反转录体系：总RNA（2 μL）、RNase Free dH2O（20 μL）、PrimeScript RT Master Mix（4 μL）］，以cDNA 为模板，采用qRT-PCR 检测样本中LncRNA XIST、miR-101-3p 的表达水平（PCR 体系：0.5 μL cDNA 模板、5 μL ddH2O、0.5 μL 正向引物、0.5 μL 反向引物、6.5 μL 2×Taq PCR master mix），条件：1 个循环（预变性：95℃，15 min），40 个循环（变性：95℃，15 s；退火延伸：65℃，45 s）。LncRNA XIST、miR-101-3p 引物及U6、3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）内参引物由广州锐博生物公司提供，引物序列见表2。每组实验重复3 次。使用2-ΔΔCt方法对LncRNA XIST、miR-101-3p 的相对表达水平进行分析。

表2 qRT-PCR引物序列

1.4 观察指标 比较两组对象外周血单核细胞LncRNA XIST、miR-101-3p 水平，分析LncRNA XIST、miR-101-3p 表达与SLE 患者特异性抗体水平的关系，比较稳定期和活动期患者外周血单核细胞LncRNA XIST、miR-101-3p 水平及SLEDAI 评分，分析患者外周血单核细胞LncRNA XIST、miR-101-3p 水平和SLEDAI 评分的相关性，分析SLE 的影响因素，分析外周血单核细胞LncRNA XIST、miR-101-3p 水平对SLE的诊断价值。

1.5 统计学方法 应用SPSS 25.0 进行数据分析，计量资料均符合正态分布用表示，两组间均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；计数资料用率表示，采用χ2检验；Spearman 法分析LncRNA XIST、miR-101-3p 与SLEDAI 评分的相关性；Pearson 法分析LncRNA XIST与miR-101-3p 表达水平的相关性；logistic 回归分析SLE 的影响因素；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析LncRNA XIST、miR-101-3p 的表达对SLE 的诊断价值；以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组对象外周血单核细胞LncRNA XIST、miR-101-3p 水平比较 对照组外周血单核细胞LncRNA XIST 水平为（1.01±0.19），观察组为（1.55±0.32）；对照组miR-101-3p 水平为（1.03±0.20），观察组为（0.62±0.18），差异均有统计学意义（t=19.467，P＜0.001；t=20.443，P＜0.001）。

2.2 LncRNA XIST、miR-101-3p 表达与SLE 患者特异性抗体水平的关系 以观察组LncRNA XIST 平均值1.55、miR-101-3p 平均值0.62 作为临界值，将180 例SLE 患者分为LncRNA XIST 高表达组（LncRNA XIST≥1.55，n=93）和LncRNA XIST 低表达组（LncRNA XIST＜1.55，n=87）；miR-101-3p 高表达组（miR-101-3p≥0.62，n=96）和miR-101-3p 低表达组（miR-101-3p＜0.62，n=84），分析二者表达水平与SLE 患者特异性抗体水平的关系。结果显示，LncRNA XIST、miR-101-3p表达水平与SLE 患者ANA、抗sm 抗体、抗dsDNA 抗体抗体水平有关（P＜0.05），LncRNA XIST 高表达者，miR-101-3p 低表达者ANA 抗体、抗sm 抗体、抗ds-DNA 抗体阳性率均高于LncRNA XIST 低表达者和miR-101-3p 高表达者（P＜0.05）。见表3。

表3 LncRNA XIST、miR-101-3p表达与SLE患者特异性抗体水平的关系

2.3 稳定期和活动期患者外周血单核细胞LncRNA XIST、miR-101-3p 水平比较 稳定期组SLE 患者外周血单核细胞中LncRNA XIST 水平为（1.35±0.27），活动期组为（1.71±0.36）；稳定期组miR-101-3p 水平为（0.77±0.23），活动期组为（0.50±0.14），差异均有统计学意义（t=7.427，P＜0.001；t=9.708，P＜0.001）。

2.4 患者外周血单核细胞LncRNA XIST、miR-101-3p水平、SLEDAI 评分的相关性 Starbase 网址预测LncRNA XIST 与miR-101-3p 间存在结合位点，SLE 患者外周血单核细胞中LncRNA XIST 与miR-101-3p 水平呈负相关（r=-0.410，P＜0.001）；LncRNA XIST 水平与SLEDAI 评分呈正相关（r=0.425，P＜0.001），miR-101-3p 水平与SLEDAI 评分呈负相关（r=-0.454，P＜0.001）。见图1～4。

图1 LncRNA XIST与miR-101-3p间结合位点

图2 SLE 患者外周血单核细胞LncRNA XIST 与miR-101-3p水平的相关性

图3 SLE 患者外周血单核细胞LncRNA XIST 水平与SLEDAI评分的相关性

图4 SLE 患者外周血单核细胞miR-101-3p 水平与SLEDAI 评分的相关性

2.5 SLE 影响因素的logistic 回归分析 以是否发生SLE 为因变量（发生=1，未发生=0），LncRNA XIST、miR-101-3p 为自变量（连续变量带入原值），采用逐步向前法进行logistic 回归分析，结果显示，LncRNA XIST是影响SLE 的危险因素（P＜0.05），miR-101-3p 是影响SLE 的保护因素（P＜0.05）。见表4。

表4 SLE影响因素的logistic回归分析

2.6 外周血单核细胞LncRNA XIST、miR-101-3p水平对SLE 的诊断价值 以LncRNA XIST、miR-101-3p 和logistic 回归模型公式（采用二元Logistic 回归分析建立LncRNA XIST、miR-101-3p 水平诊断SLE 的联合检测方程：Logit（P）=-0.781×miR-101-3p+1.177×LncRNA XIST+1.374，）计算两指标联合诊断SLE 发生的概率值为检验变量，以患者发生SLE 为状态变量（是=1，否=0）绘制ROC 曲线。结果显示，LncRNA XIST、miR-101-3p、二者联合诊断SLE 的AUC 分别为0.900、0.917 和0.960，二者联合均优于其各自单独诊断（Z二者联合-Ln-cRNAXIST=3.268，P=0.001；Z二者联合-miR-101-3p=2.584，P=0.005）。见表5、图5。

图5 外周血单核细胞LncRNA XIST、miR-101-3p 水平诊断SLE的ROC曲线

表5 外周血单核细胞LncRNA XIST、miR-101-3p水平对SLE的诊断价值

3 讨论

SLE 是可以影响所有年龄、种族和性别的一种疾病，其中女性患者占比较高，具有一定的异质性，疾病活动会有很大的波动，会随着时间的推移而改变，其严重程度也可从轻度皮肤损伤到严重器官损伤，其结果也可从持续缓解到死亡［10-11］。研究发现，SLE 是由自身免疫缺陷引起的，一些生物标志物如miR-223、白介素-1 受体相关激酶-M、程序性死亡配体2 等与T 淋巴细胞功能、炎症因子的产生、免疫耐受功能等有关，影响免疫应答与炎症反应，从而用于分析SLE［12-14］。因此，寻找与SLE 相关的生物标志物，及时加以干预，对患者具有较大的帮助。

LncRNA XIST 位于X 染色体失活中心，能够调节X 染色体失活，能够引起女性细胞发育过程中一条X染色体的遗传沉默，影响成纤维细胞样滑膜细胞增殖和促炎细胞因子的产生［15］。研究发现，LncRNA XIST可以改变患者外周血免疫细胞的平衡，导致患者出现免疫失调和组织损伤，且能够很好地诊断SLE［16］。Cheng 等［17］研究发现，LncRNA XIST 表达与SLEDAI 呈正相关，在有效治疗后显著降低，且LncRNA XIST 高表达的患者CD4+T 细胞水平升高，NK 细胞水平降低。miR-101-3p 是miR-101 的一种活性形式，广泛存在于真核细胞中，在炎症相关疾病中影响炎症因子的表达［18］。Sun 等［19］研究发现，与健康个体相比，SLE 患者外周血单核细胞中miR-101-3p 的表达水平显著降低，与白细胞介素-17A、白介素-6 和干扰素-γ 呈负相关。Zhao 等［20］研究发现，miR-101-3p 在SLE 患者外周血单核细胞中表达下调，而过表达的miR-101-3p 可以阻断NF-κB 信号通路，影响Th17 细胞分化，起到抑炎的作用。本研究结果发现，与对照组相比，观察组SLE 患者外周血单核细胞LncRNA XIST 水平升高，miR-101-3p 水平降低，且LncRNA XIST 高表达者，miR-101-3p低表达者ANA 抗体、抗sm 抗体、抗dsDNA 抗体阳性率均高于LncRNA XIST 低表达者和miR-101-3p 高表达者，与相关研究［16，19］结果基本一致，表明LncRNA XIST、miR-101-3p 与SLE 具有一定的关系，且进一步结果显示活动期组较稳定期组SLE 患者外周血单核细胞中LncRNA XIST 水平升高，miR-101-3p 水平降低；LncRNA XIST 水平与SLEDAI 评分呈正相关，miR-101-3p 水平与SLEDAI 评分呈负相关，提示LncRNA XIST、miR-101-3p 与SLE 疾病活动性密切相关，通过检测患者外周血单核细胞中LncRNA XIST、miR-101-3p 的水平可以对SLE 的活动性进行判断。研究发现，LncRNA XIST 能够调节miRNA 参与非癌症相关疾病的发展和进展［21］。本研究结果发现，Starbase 网址预测LncRNA XIST 与miR-101-3p 间存在结合位点，患者外周血单核细胞LncRNA XIST 与miR-101-3p 水平呈负相关，与Li 等［22］结果基本一致，表明LncRNA XIST 与miR-101-3p 之间存在靶向作用。本研究logistic 回归分析结果显示，LncRNA XIST 是影响SLE 的危险因素，miR-101-3p 是影响SLE 的保护因素。推测高水平的LncRNA XIST 可以靶向调节miR-101-3p，促进促炎因子的产生，影响患者免疫平衡，导致SLE 的发生。ROC曲线分析显示，LncRNA XIST、miR-101-3p 联合诊断SLE 的AUC 为0.960，均优于其各自单独诊断，对SLE具有较好的诊断价值。提示LncRNA XIST、miR-101-3p 可有效地诊断SLE，当LncRNA XIST＞1.14，miR-101-3p＜0.86 时，应在临床上快速制定诊疗方案，保障患者的生命安全。

综上，SLE 患者外周血单核细胞LncRNA XIST 水平升高，miR-101-3p 水平降低，与SLE 疾病活动性有关，对SLE 具有一定的诊断价值。然而仍需大量样本对患者外周血单核细胞LncRNA XIST、miR-101-3p 在SLE 中的临床价值进行探究，并进一步探究二者在SLE中的作用机制。