外周血CD4+CD25+Treg细胞、TLR4、hCMV-IgM与动脉粥样硬化型急性脑梗死患者颈动脉粥样硬化的关系

杨琪, 李芳芳

1.松滋市人民医院神经内科,湖北松滋434200;2.华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,湖北武汉430030

急性脑梗死是一种突发性的脑血管疾病,动脉粥样硬化型急性脑梗死(atherosclerotic acute cerebral infarction,As-ACI)是急性脑梗死的临床类型之一,其发病原因主要是脑部动脉粥样硬化和血栓形成[1]。大部分As-ACI患者本身存在过度炎症反应,使体内致病性、免疫调节性T细胞动态平衡失调,CD4+CD25+Treg细胞属于免疫调节性T细胞,参与各种疾病发生的免疫调节过程[2]。Toll样受体4(Toll-1ike receptor 4,TLR4)可介导免疫反应和炎症反应,与脂质炎症反应、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化有关[3]。当机体免疫力降低时,人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,hCMV)激活,对血管内皮损伤产生影响[4]。颈动脉是血液运输至大脑的主要大血管,颈动脉粥样斑块的形成和颈动脉狭窄程度是引起脑梗死发病的主要原因之一[5]。因此,本研究探讨外周血CD4+CD25+Treg细胞、TLR4、hCMV-IgM与As-ACI患者颈动脉粥样硬化的关系,为临床确定As-ACI针对性治疗方案提供参考。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取本院2021年10月—2022年9月As-ACI患者89例为脑梗死组。纳入标准:均符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》[6]诊断标准且经影像学检查确诊为As-ACI;年龄>40岁;发病至入院时间<24 h;首次发病。排除标准:合并恶性肿瘤、血液疾病、感染性疾病;1个月内服用免疫功能调节药物、手术史。另选同期体检健康成人43例为对照组。两组一般资料(高血压除外)比较差异无显著性(P>0.05;表1)。纳入对象及其家属对本研究均知情,自愿签署知情同意书。本研究方案经本院伦理委员会批准(20201121)。

表1 脑梗死组与对照组一般资料的比较

1.2 颈动脉超声检查

受检者取仰卧位,头后仰,使用彩色多普勒超声诊断仪(xMATRIXiE33,飞利浦),探头频率2～3 MHz,检测颈内动脉内膜中膜厚度(intima-media thickness,IMT),IMT<1.0 mm为颈内动脉内膜正常,1.0～1.5 mm为颈内动脉内膜增厚,≥1.5 mm且伴有内膜向管腔凸出为有粥样硬化斑块形成[7],当动脉管腔狭窄≥50%为动脉狭窄[8]。根据颈内动脉超声结果将As-ACI患者分为内膜正常组、内膜增厚组、斑块组、狭窄组。

1.3 外周血CD4+CD25+Treg细胞、TLR4的检测

取入院次日清晨空腹静脉血5 mL置于抗凝管中,取两支流式试管分别标为对照管和实验管,分别加入100 μL抗凝血,实验管中加入10 μL CD4-PE、10 μL CD25-FITC,对照管中加入10 μL CD4-PE、10 μL IgGl-FITC,加入500 μL PBS重悬后用于流式细胞仪(BD FACSCanto II,埃克森北京科技有限公司)上样,采用Cellques软件对CD4+CD25+Treg细胞构成百分比进行统计。TLR4表达水平检测同上,实验管中加入5 μL TLR4-PE、10 μL CD14-FITC,对照管中加入5 μL IgGl-PE、10 μL CD14-FITC,Cellques软件统计CD14+TLR4+细胞构成百分比。

1.4 hCMV感染诊断

取2 mL清晨空腹静脉血,室温放置10 min,3 500 r/min离心20 min,收集上清液,采用ELISA法检测血清hCMV-IgM抗体阳性率,试剂盒购于武汉纯度生物科技有限公司,使用酶标仪(美国Muhiskun公司)在450 nm波长检测光密度值。临界值=校正对照光密度值×相关系数,Index值=样本光密度值/临界值,Index值≥1为阳性[9]。分析各组hCMV感染阳性率变化。

1.5 生物化学指标的检测

患者入院后次日,取3 mL空腹静脉血,日立7170A/AU2700全自动生化分析仪检测总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDLC)水平。取1.4中上清液,使用美谷SpectraMax M5多功能酶标仪酶联免疫吸附法检测超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)水平,试剂盒购于武汉益普生物科技有限公司。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 各组CD4+CD25+Treg细胞、TLR4等指标的比较

脑梗死组CD4+CD25+Treg细胞、HDLC水平低于对照组,TLR4表达、hCMV-IgM抗体阳性率、TC、TG、LDLC、hs-CRP水平和IMT高于对照组(P<0.05;表2)。狭窄组hs-CRP水平高于内膜正常组、内膜增厚组(P<0.05;表2)。内膜正常组、内膜增厚组、斑块组、狭窄组CD4+CD25+Treg细胞水平依次降低,TLR4表达、hCMV-IgM抗体阳性率和IMT依次增高(P<0.05;表2)。

表2 各组CD4+CD25+Treg细胞、TLR4等指标的比较

2.2 CD4+CD25+Treg细胞、TLR4与IMT的相关性

CD4+CD25+Treg细胞水平与IMT呈负相关(r=-0.243,P=0.022),TLR4表达与IMT呈正相关(r=0.239,P=0.024;图1)。

图1 CD4+CD25+Treg细胞、TLR4表达水平与IMT的相关性

2.3 As-ACI患者颈动脉狭窄的危险因素分析

以颈动脉狭窄为因变量,以上述有差异的因素为自变量,Logistic回归分析显示,高血压、CD4+CD25+Treg、TLR4、hCMV-IgM抗体阳性是As-ACI患者颈动脉狭窄的危险因素(P<0.05;表3)。

表3 As-ACI患者颈动脉狭窄危险因素Logistic回归分析

2.4 CD4+CD25+Treg细胞、TLR4对颈动脉狭窄的预测价值

CD4+CD25+Treg细胞、TLR4联合检测的预测价值高于其单独检测(P<0.001;表4和图2)。

图2 CD4+CD25+Treg细胞、TLR4预测颈动脉狭窄的ROC曲线

表4 CD4+CD25+Treg细胞、TLR4表达对颈动脉狭窄的预测价值

3 讨 论

近年来急性脑梗死发病呈年轻化趋势,动脉粥样硬化发病过程存在炎症免疫性反应,过度炎症反应所致脑组织损伤程度比脑组织本身缺血引起的脑损伤更严重,抑制脑组织过度炎症反应有助于调节性T细胞和致病性T细胞动态平衡恢复[10]。CD4+CD25+Treg细胞是经Th1细胞分化形成的免疫细胞,能够通过分泌炎性相关因子调节机体炎症/抗炎平衡、自身免疫耐受和免疫抑制作用[11]。本研究结果显示,As-ACI患者外周血CD4+CD25+Treg细胞水平低于健康体检成人,随着颈动脉粥样硬化病变程度加重呈减低趋势,可能是因为急性脑梗死早期炎症反应主要表现为局部组织促炎反应,单核巨噬细胞、树突细胞以及辅助性T细胞等致病性细胞含量增加,导致趋化性细胞分子等促炎因子表达水平升高,由损伤血脑屏障进入损伤炎症区域加重局部炎症反应,从而导致CD4+CD25+Treg细胞水平降低。

TLR4在动脉粥样硬化斑块中呈高表达水平,通过氧化型低密度脂蛋白刺激单核细胞向巨噬细胞和泡沫细胞分化,而通过阻断TLR4疾病表达可以降低巨噬细胞脂质沉积、泡沫细胞分化和斑块炎症因子高表达[12]。有学者认为,TLR4水平升高不利于急性脑梗死患者静脉溶栓后侧支循环开放,影响患者溶栓治疗效果[13]。本研究结果显示,As-ACI患者外周血单个核细胞TLR4表达水平显著高于健康体检成人,并且随着颈动脉粥样硬化病变程度加重呈增长趋势,说明TLR4可能参与As-ACI发病过程。本研究结果显示,As-ACI患者外周血hCMV-IgM阳性率明显升高,可能是因为hCMV感染可抑制一氧化氮合成分泌,诱导血液促凝状态形成,增加血栓形成率;hCMV感染还可引起机体炎症反应增强,增加脂质沉积现象,促进血管平滑肌细胞增殖,导致动脉粥样硬化并发动脉狭窄。

本研究结果显示,CD4+CD25+Treg细胞水平与IMT呈负相关,而单个核细胞TLR4表达水平与IMT呈正相关,同时发现CD4+CD25+Treg细胞和单个核细胞TLR4表达水平对脑梗死颈动脉狭窄具有良好的预测效能,两者联合检测高于其单独预测效能,高血压、CD4+CD25+Treg、TLR4、hCMV-IgM抗体阳性是其危险因素。毛可适等[14]研究结果表明,颈动脉狭窄老年As-ACI患者外周血CD4+CD25+Treg细胞百分比与IMT呈负相关,还能作为脑缺血和血管内皮功能的非侵入性指标。还有学者认为,CD4+CD25+Treg细胞水平可以作为老年As-ACI的独立影响因素,对疾病严重程度具有预测效能[15]。本研究结果也具有相似趋势,说明外周血CD4+CD25+Treg细胞水平降低、单个核细胞TLR4表达水平增加和hCMV感染可能会加重脑梗死颈动脉粥样硬化病变严重程度。

综上所述,CD4+CD25+Treg细胞水平在动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血呈降低趋势,而外周血单个核细胞TLR4表达水平和hCMV感染阳性率呈升高趋势,随颈动脉粥样硬化严重程度增加而趋势更明显,CD4+CD25+Treg细胞和单个核细胞TLR4表达水平联合检测可提高脑梗死颈动脉狭窄预测效能。但本研究纳入病例不足,有待大样本研究验证。