circ0000799经miR-1287-5p/GPX4轴调控铁死亡促进三阴乳腺癌脑转移

刘庆, 宋彩露, 刘凌蕊, 许嫒淇, 莫运仙

中山大学肿瘤防治中心,广东广州510060

三阴乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)及人表皮生长因子受体表达均为阴性的乳腺癌,其主要特点为发病年龄早、侵袭性强、治疗效果差、复发转移率高、生存预后差[1-2],常见转移部位包括骨、肺、肝和脑,其中脑转移发生率最高[3]。由于缺乏有效治疗靶点及预后指标,目前三阴乳腺癌脑转移仍缺乏有效治疗手段。环状RNA(circRNA)为共价闭合结构的单链非编码RNA,circRNA在多种恶性肿瘤中表达异常,是潜在的肿瘤治疗靶点[4-5]。有研究显示,circ0000799在膀胱癌中表达上调且与预后密切相关[6]。因此,本研究探究circ0000799经miR-1287-5p/GPX4轴对铁死亡促进三阴乳腺癌脑转移的影响,为三阴乳腺癌脑转移研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)及GAPDH抗体(CST,美国),DMEM、RPMI 1640及DMEM/F12培养基、马血清、胎牛血清(Gibco,美国),慢病毒质粒(sh-circ0000799)及其对照(sh-circCTR)、miR-1287-5p模拟物(miR-1287-5p)及其对照(miR-CTR)、(1S,3R)-RSL3(翌圣,中国),RNase R酶、细胞核/胞质细胞组分提取试剂盒(碧云天,中国),TaqMan反转录及荧光定量PCR试剂盒(Takara,日本),0.8 nm Transwell小室及基质胶(BD,美国),谷胱甘肽(glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)定量分析试剂盒(ab138881,美国)。

1.2 临床标本

收集本院2018年5月15日—2023年5月15日三阴乳腺癌脑转移患者10例,年龄(39.5±8.9)岁。取术中新鲜样本,按病理号分别保存患者原发灶、脑转移灶和癌旁组织,提取组织RNA -80 ℃备用。本研究经本院伦理委员会批准,所有患者或家属知情同意。

1.3 细胞培养及稳定转染细胞株构建

人正常乳腺上皮细胞MCF-10A、非三阴乳腺癌细胞系(MCF-7、T47D、BT-474、SKBR-3、HCC-38)、亲代三阴乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-468)、子代脑转移三阴乳腺癌细胞系(MDA-MB-231-BM、BT-549-BM)[7-8]来源于ATCC组织。MCF-10A细胞培养于含1%马血清、20 ng表皮生长因子、0.5 μg氢化可的松、10 mg/L胰岛素及1%双抗的DMEM/F12培养基中;其他细胞均培养于含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM或RPMI 1640培养基中。根据转染敲低RNA(short hairpin RNA,shRNA)不同,细胞分为sh-circCTR组和sh-circ0000799组。分别转染sh-circCTR和sh-circ0000799至MDA-MB-231和MDA-MB-231-BM细胞中,qRT-PCR验证circ0000799敲低效率。

1.4 qRT-PCR

提取细胞及组织总RNA,以RNA为模板,根据Takara提供的反转录、荧光定量PCR试剂盒说明书,分析circ0000799表达量(使用IQTM5 Multicolor实时荧光定量系统,美国BioRad)。circ0000799及其对照引物分别用于qRT-PCR,反应体系为20 μL,以U6为内参,引物序列hsa_circ_0000799(circ-BPTF):F5′-CCCCATTTTACCAGTGTGCAG-3′,R5′-GCTGGACCCACACTTGATGA-3′;U6:F5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用2-ΔΔCT公式计算circ0000799表达量,每组含3个复孔。

1.5 Transwell实验

将稳定转染sh-circCTR和sh-circ0000799慢病毒质粒的MDA-MB-231和MDA-MB-231-BM细胞分别制成2×105个/mL单细胞悬液。在Transwell上腔层中铺加基质胶,培养箱内静置6 h成膜后取出。每个小室上腔层加入150 μL单细胞悬液,下腔层加入350 μL含20%FBS培养基,培养24 h后取出小室,结晶紫染色,去除、清洗并晾干小室后,镜下计数染色细胞。

1.6 RNase R酶消化实验

提取MDA-MB-231细胞总RNA,分为RNase R组(加RNase R消化)和对照组(不加RNase R消化)。于PCR仪中分别经37 ℃、70 ℃反应30 min及10 min使酶灭活,并进行反转录反应,分别使用根据环状RNA circ0000799接口处设计的引物、其线性亲本基因BPTF设计的引物,进行qRT-PCR检测,比较环状circ0000799及其线性亲本基因BPTF分别经30 min RNase R处理后的mRNA表达水平,明确circ0000799在MDA-MA-231细胞中的结构稳定性。

1.7 circ0000799亚细胞定位实验

按照细胞核/细胞质细胞组分提取试剂盒的说明书进行操作,提取MDA-MA-231细胞的胞质及胞核RNA,qRT-PCR分别检测circ0000799、细胞质对照β-actin、细胞核对照18S在细胞质和细胞核中的表达量,根据两者比例作图。

1.8 双荧光素酶报告基因实验

将2×104个MDA-MB-231细胞接种到6孔板培养24 h。使用Lipo 3000分别共转染野生型circ0000799、突变型circ0000799,或野生型GPX4、突变型GPX4,或miR-1287-5p、miR-CTR,按试剂盒说明书进行操作[9],分别验证circ0000799与miR-1287-5p,以及miR-1287-5p与GPX4之间的结合关系。

1.9 GSH和GSSG定量分析

细胞分为sh-circ0000799组和sh-circCTR组。据说明书操作,将脱蛋白样品和标准品分别加入孔中,并在测定缓冲液中加入Thiol Green用于GSH检测,或加入GSSG探针用于总谷胱甘肽(GSH+GSSG)检测。将混合物室温孵育30 min后,使用酶标仪分析样品。计算总GSH/GSSG比值。

1.10 蛋白质印迹分析

细胞分为sh-circ0000799组和sh-circCTR组。RIPA裂解法从MDA-MB-231细胞提取分离总蛋白,进行SDS-PAGE凝胶分离蛋白,300 mA转PVDF膜2 h。4 ℃ 1∶1 000 GPX4和GAPDH一抗分别孵育过夜,室温下采用特异性二抗孵育2 h,显影成像,使用Image J进行定量分析。

1.11 小鼠体内脑转移模型构建

15只4周龄BALB/c裸鼠随机分为3组,每组5只,分别为sh-circCTR组、sh-circ0000799组、sh-circ0000799+RSL3组。将稳定转染细胞株经左心室注射到裸鼠体内以构建脑转移模型,其中sh-circ0000799+RSL3组在注射sh-circ0000799稳定转染细胞株后的第7周开始进行铁死亡诱导剂100 mg/kg RSL3皮下注射治疗,每周2次,持续2周。第8周后结束实验,处死小鼠,取脑组织进行HE染色,镜下统计脑转移结节数目并记录。

1.12 统计学分析

2 结 果

2.1 circ0000799在乳腺癌细胞系及组织中的表达

与MCF-10A和癌旁组织比较,circ0000799在三阴乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中上调,且在子代三阴乳腺癌细胞系及脑转移灶中上调最为显著(P<0.05;图1)。

图1 circ0000799在乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中的表达a为P<0.05,与MCF-10A比较;b为P<0.05,与非三阴乳腺癌细胞系(MCF-7、T47D、BT-474、SKBR-3、HCC-38)比较;c为P<0.05,与亲代三阴乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-468)比较;d为P<0.05,与癌旁组织比较;e为P<0.05,与原发灶组织比较。

2.2 circ0000799对细胞生长的影响

sh-circ0000799敲除效率在MDA-MB-231、MDA-MB-231-BM中得到验证(P<0.05;图2A)。与sh-circCTR组比较,sh-circ0000799组MDA-MB-231、MDA-MB-231-BM细胞生长能力显著降低(P<0.05;图2B)。即外源性沉默circ0000799可降低亲代MDA-MB-231和子代脑转移性MDA-MB-231-BM细胞生长能力。

图2 circ0000799对乳腺癌细胞生长的影响A为MDA-MB-231和MDA-MB-231-BM中circ0000799敲低效率;B为细胞生长曲线。a为P<0.05,与sh-circCTR组比较。

2.3 circ0000799对细胞侵袭能力的影响

与sh-circCTR组比较,sh-circ0000799组MDA-MB-231、MDA-MB-231-BM细胞侵袭细胞数降低(P<0.05;图3),即外源性沉默circ0000799可降低亲代MDA-MB-231和子代脑转移性MDA-MB-231-BM细胞侵袭能力。

图3 circ0000799对乳腺癌细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色,100×)a为P<0.05,与sh-circCTR组比较。

2.4 circ0000799对三阴乳腺癌细胞脑转移的影响

sh-circCTR组、sh-circ0000799组、sh-circ0000799+RSL3组脑转移结节数量依次降低[(2.4±0.49)个比(1.2±0.4)个比(0.2±0.4)个,P<0.05;图4]。

图4 circ0000799对三阴乳腺癌细胞脑转移的影响(HE染色)

2.5 circ0000799结构稳定性鉴定及定位

与对照组比较,RNase R酶处理后环状RNA circ0000799表达无显著变化(P>0.05),而其线性BPTF表达降低(P<0.05;图5)。胞质circ0000799表达高于胞核(P<0.05;图5),即circ0000799亚细胞定位主要为细胞质。

图5 circ0000799结构稳定性鉴定及定位A为circ0000799和BPTF的表达;B为circ0000799的亚细胞定位。a为P<0.05,与对照组比较;b为P<0.05,与同组细胞核比较。

2.6 circ0000799可能通过miR-1287-5p/GPX4调控铁死亡促进乳腺癌脑转移

生物信息学软件circInteractome和TargetScan预测,且双荧光素酶报告基因实验显示,circ0000799可与miR-1287-5p相互作用,miR-1287-5p可与GPX4相互作用(图6A)。与sh-circCTR组比较,sh-circ0000799组miR-1287-5表达增加;与miR-CTR组比较,miR-1287-5p组GPX4 mRNA表达降低(P<0.05;图6B)。敲除circ0000799后,细胞内总GSH/GSSG比(图6C)和GPX4表达降低(P<0.05;图6D)。

图6 circ0000799可能通过miR-1287-5p/GPX4调控铁死亡促进乳腺癌脑转移A为生物信息学软件和双荧光素酶报告基因实验;B为qRT-PCR;C为总GSH/GSSG定量分析柱状图;D为Western blotting(1为sh-circCTR组;2为sh-circ0000799组)。a为P<0.05,与miR-CTR组比较;b为P<0.05,与sh-circCTR组比较。

3 讨 论

circRNA在多种组织和细胞中均有广泛分布,具有一定的特异性[10]。具有共价闭环结构的circRNA在多种生物学过程中发挥着不可替代的作用[11]。随着高通量技术不断完善,不断有新的circRNA被发现并探究其与肿瘤进展之间的相关性[12]。circRNA已被证实为潜在的肿瘤治疗靶点。环状RNA circ0000799(hsa_circRNA_0000799,chr17:65941524-65972074)为一种来源于BPTF基因外显子的新型circRNA(circBPTF)。研究显示,circ0000799在膀胱癌中表达上调且与患者肿瘤分级呈正相关,与患者预后呈负相关,且该过程可能是通过海绵吸附miR-31-5p靶向上调RAB27A表达而实现的,是膀胱癌治疗的一个潜在靶点[6]。本研究通过检测circ0000799在乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中的表达发现,circ0000799在所有乳腺癌细胞系中均表达上调,且相对于亲代三阴乳腺癌细胞系,子代脑转移细胞系中上调最为显著;而在10例乳腺癌原发灶、脑转移灶及癌旁组织中的表达结果也一致,即在三阴乳腺癌脑转移灶组织中的表达上调最为显著。该结果与膀胱癌[6]结果较为一致,同时也说明circ0000799可能是三阴乳腺癌脑转移密切相关的一个circRNA。随后通过shRNA敲低circ0000799在亲代和子代脑转移性三阴乳腺癌细胞系中的表达,发现敲低circ0000799可显著抑制细胞生长、侵袭及脑转移能力。

铁死亡是一种铁离子依赖型的脂质过氧化物损伤所引起的细胞程序性死亡的现象,其遗传学背景、生化调节模式及形态学特征均不同于以往的凋亡、自噬、焦亡和坏死等经典细胞死亡模式,是近年来新发现的一种细胞死亡模式,以铁离子、活性氧和脂质过氧化物堆积、胱氨酸/谷氨酸反向转运体抑制、谷胱甘肽合成减少、还原型辅酶Ⅱ被氧化等为其典型的生化特征[13]。铁死亡发生的机制为细胞内游离铁离子与过氧化物发生芬顿反应,从而使生物膜上的多不饱和脂肪酸进一步过氧化,该过程受多种基因调控,如调控铁代谢相关的血红素加氧酶1、抗氧化代谢相关的胞质接头蛋白、能量代谢相关的谷氨酰胺酶2,以及脂质代谢相关的GPX4[14]。GPX4可特异性清除脂质过氧化物,并有效抑制铁死亡发生[15]。研究显示,抑制GPX4的表达或活性,可促进肿瘤细胞铁死亡的发生,从而抑制肿瘤的生长和转移[16-17]。本研究发现,由子代脑转移性三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231-BM通过左心室注射构建的脑转移模型中,在敲低circ0000799后脑转移结节数显著降低,且在与铁死亡诱导剂RSL3连用后,脑转移结节数接近消失。同时MDA-MB-231细胞中总GSH/GSSG随circ0000799的抑制而显著降低,同时铁死亡相关标志物GPX4蛋白的表达也显著降低,上述结果均表明三阴乳腺癌脑转移与铁死亡密切相关。已有研究显示,铁死亡可能通过破坏铁离子稳态而参与乳腺癌的脑转移。铁代谢与铁的吸收、利用、储存和输出密切相关,高铁水平会产生活性氧,并决定细胞对铁死亡的敏感性,容易转移的癌症细胞通常非常容易发生铁死亡[14]。本研究与文献[14]结果一致,circ0000799调控三阴乳腺癌的脑转移可能是通过铁死亡实现的。

本研究通过结构稳定性鉴定及亚细胞定位,确定了circ0000799的结构稳定性及其发挥生物学活性的主要位置为细胞质。随后通过生物信息学软件预测,发现circ0000799可与miR-1287-5p结合,而GPX4是miR-1287-5p的下游靶基因。研究显示,circRNA通过海绵吸附miRNA,竞争性结合miRNAs以调节miRNAs下游基因表达[18]。本研究通过双荧光素酶报告基因和qRT-PCR实验,证实了circ0000799与miR-1287-5p、GPX4与miR-1287-5p之间的相互结合关系,即circ0000799-miR-1287-5p-GPX4轴在三阴乳腺癌脑转移中发挥重要作用,该作用最终通过促进GPX4表达抑制铁死亡而促进脑转移,且Western blotting实验也证实了抑制circ0000799可显著抑制GPX4蛋白表达,进一步证实了三者间的调控关系。而在膀胱癌中也证实circ0000799可通过miR-31-5p/RAB27A轴而促进膀胱癌的恶性进展[6]。该结果与胞质circRNA可作为miRNA海绵调控下游关键基因的结果一致[19]。

目前该机制的严谨性仍待完善,后续将纳入多株亲代及子代转移性三阴乳腺癌细胞系、临床脑转移样本,并进行RIP、qRT-PCR、体内实验活体成像等实验进一步验证。本研究初步证实circ0000799与三阴乳腺癌脑转移的密切关联,该过程可能是通过调控miR-1287-5p/GPX4轴而实现的,该结果可能为提高三阴乳腺癌脑转移患者的预后提供新思路。