鹅粪便中副干酪乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌的分离及鉴定

高炳南，岳学青，王秋菊，曹雨涵，任雨龙，孙愉，魏笑，张昊

黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163311

我国是养殖大国，2019 年生猪出栏量6.85 亿头，肉牛出栏量0.45 亿头，家禽146.4 万只，共生产肉制品7 759.5 万吨［1］。养殖过程中抗生素的大量使用及滥用成为人们关注的重要食品安全问题之一。为了尽快减少使用兽用抗生素，2017 年6 月22日，我国农业部发布了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划（2017—2020年）》，以促进抗生素药物逐步退出市场［2］。因此，安全的抗生素替代品成为畜牧业研究的重点。益生菌具有促进消化、改善养殖环境、抗菌作用、增强动物免疫力和促进生长发育的功能，且不产生耐药性，给药简单，可自我繁殖，用量较少［3］，有望成为抗生素替代品。我国2014年2 月1 日起实施的《饲料添加剂品种目录（2013）》中，微生物菌种共有46种［4］。

副干酪乳酸杆菌是革兰阳性细菌，兼性厌氧、无运动、无芽孢的杆菌或长杆菌，具有较好的耐酸、耐胆盐能力，且可为肠道提供屏障作用［5］。副干酪乳酸杆菌可产生有机酸、细菌素和苯乳酸等，可有效减少致病微生物的侵袭，不仅具有良好的抗氧化能力，还可减少TNF-α、IL-6、IFN-g、IL-12 等促炎细胞因子的分泌，从而缓解肠道炎性反应［6］。OSMAN 等［7］用副干酪乳酸杆菌饲喂高脂白鼠，结果表明，副干酪乳酸杆菌通过促进谷胱甘肽过氧化物酶及过氧化氢酶等产生，加快脂肪代谢，可作为抗血脂异常药的替代品。

枯草芽孢杆菌是一类需氧革兰阳性菌，呈圆柱状，无荚膜，可运动，可形成芽孢。枯草芽孢杆菌繁殖时需要消耗大量氧气，可促进肠道内厌氧菌生长，如双歧杆菌、乳酸杆菌；且可抑制大肠埃希菌、沙门菌和葡萄球菌等致病菌的生长［8］。CHEN等［9］利用枯草芽孢杆菌亚种（Bacillus subtilisvar.nattoN21，BAC）和酿酒酵母Y10（Saccharomyces cerevisiaeY10，SAC）对液体饲料发酵（fermented liquid feed，FLF）后，饲喂朗德鹅，可提高其生长速度和采食量，调节肠道生态，降低血胆固醇浓度，改善器官和胸肌的抗氧化状态。WANG 等［10］通过饲喂锰和枯草芽孢杆菌可改善46 周龄成鹅的生产性能、蛋品质、抗氧化能力和肠道菌群的构建。上述结果表明，枯草芽孢杆菌可促进动物的生长。本研究旨在从北方白鹅体内分离获得副干酪乳酸杆菌亚种（Lactobacillus paracasei subsp）和枯草芽孢杆菌KA9（Bacillus subtilisKA9），并评估其生长和耐酸耐胆盐特性及抗生素耐受性，以期为鹅源微生态制剂提供候选菌株。

1 材料与方法

1.1样品 采集于黑龙江省某种鹅场，选择30 只52周龄雄性北方白鹅，采食后30 min，于白鹅泄殖腔外挂粪便采集盒，收集无污染的新鲜粪便，置冰袋冷冻保存。

1.2培养基 MRS培养基（货号：HB0384）、甘露醇卵黄多黏菌素培养基（货号：HB0248）、LB 培养基（货号：HB0128）和NA 培养基（货号：HB0109）均购自青岛海博生物技术有限公司。

1.3抗生素 β 内酰胺类（阿莫西林、氨苄西林、亚胺培南、头孢呋辛、头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南、哌拉西林）、四环素类（四环素）、喹诺酮类（左氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星）、氨基糖苷类（阿米卡星、链霉素、庆大霉素）、氯霉素类（氯霉素）抗生素药片均购自杭州滨河微生物试剂有限公司。

1.4菌株的分离 无菌条件下取粪便1 g，于9 mL生理盐水中，混匀，制备为混合液，取100 µL，用生理盐水进行10-5、10-6和10-7稀释。各稀释度分别取100µL，分别采用MRS 和甘露醇卵黄多黏菌素培养基培养，于37 ℃恒温培养箱内培养48 h；挑选奶白色光滑（副干酪乳酸杆菌）及黄色（枯草芽孢杆菌）菌落，分别接种至MRS 和甘露醇卵黄多黏菌素平板，继续培养48 h，获得纯化菌株，用30%甘油保存。将副干酪乳酸杆菌及枯草芽孢杆菌纯化菌株分别用LB 培养基和NA 培养基培养，经革兰染色进行初筛；通过牛津杯法检测初筛菌株对E.coli的抑菌特性，选择抑菌效果最好的副干酪乳酸杆菌及枯草芽孢杆菌，分别编号为S00834-8 和IS00439-2，用于后续试验。

1.5菌株的鉴定 以文献［11］中扩增细菌16S DNA V3区的引物为扩增引物，357f：5′-GC clamp-TACGGGAGGCAGCAG-3′，519r：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。煮沸法提取1.4项获得的2株菌株DNA，以其为模板进行PCR扩增，扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行16S DNA 测序，将获得的微生物DNA 序列与NCBI 基因库进行比对，应用MEGA 7 软件构建系统进化树，DNAstar 11.0 软件中MegAlign 程序进行同源性比较。

1.6益生菌生长特性的检测

1.6.1时间特性 取S00834-8 和IS00439-2 菌株，按2.0%接种于100 mL LB液体培养基（pH 7.0）中，以未接种的LB液体培养基作为空白对照，37 ℃，150 r／min培养48 h，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36 和48 h 取培养液，用紫外可见分光光度计测定A600。

1.6.2温度特性 取S00834-8 和IS00439-2 菌株，按2.0%接种于100 mL LB 液体培养基（pH 7.0）中，以未接种的LB 液体培养基作为空白对照，分别于34、36、37、38、40 ℃，150 r／min培养24 h，用紫外可见分光光度计测定A600。

1.6.3酸碱特性 取S00834-8 和IS00439-2 菌株，按2.0%接种于100 mL LB液体培养基中，培养基pH分别调节为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，以未接种的LB液体培养基作为空白对照，37 ℃，150 r／min培养24 h，用紫外可见分光光度计测定A600。

1.6.4耐酸耐胆盐特性 取S00834-8 和IS00439-2菌株，按2.0%接种于100 mL 不同pH（2.0、2.5、3.0、3.5、7.0）及不同胆盐浓度（0、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%）的LB液体培养基，以未接种的LB液体培养基作为空白对照组，均于37 ℃，150 r／min 培养24 h，用紫外可见分光光度计测定A600。

1.6.5抗生素耐受性 将NA 培养基经高压灭菌后，倒入培养皿内，分别涂布100µL S00834-8和IS00439-2菌液（活菌数≥1 × 109cfu／mL），将1. 3 项中的抗生素药片轻轻按压至培养基上，37 ℃恒温培细胞养箱培养24 h，测量抑菌圈直径。按美国SCLA 抗微生物敏感性试验执行标准M100 判定菌株的抗生素耐受性，见表1。

表1 菌株抗生素耐受性的判定标准Tab.1 Judgment criteria of antibiotic resistance of strains

1.7数据分析 应用Excel 2010 初步整理试验数据，GraphPad Prim 8.0软件绘图。

2 结果

2.1益生菌的筛选及鉴定 分离获得的菌株经革兰染色检测，呈短杆状链状排列，为副干酪乳酸杆菌；菌体长而细分散或成对出现，单体呈圆，为枯草芽孢杆菌。见图1。牛津杯法检测结果表明，抑菌圈直径越大，其对E.coli抑制程度越强，2 个菌株均在浓度1×107cfu／mL 时的抑菌圈直径最大，见图2。

图1 益生菌菌体形态的镜下观察（革兰染色，×1 000）Fig.1 Microscopy of probiotics cell morphology（Gram staining，×1 000）

图2 牛津杯法检测益生菌对大肠埃希菌的抑菌特性Fig.2 Detection of antibacterial characteristics of probiotics against E.coli by oxford cup method

2.2菌株的鉴定 S00834-8和IS00439-2菌株DNA扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，均可见1 750 bp的目的条带，大小与预期一致，见图3。测序结果表明，S00834-8 菌株与乳酸杆菌属中副干酪乳酸杆菌亚种耐受性H（MG818769.1）的同源性为97.1%；IS00439-2 菌株与芽孢杆菌属中枯草芽孢杆菌KA9（MT491101.1）的同源性为100%。见图4、表2和表3。

图3 S00834-8和IS00439-2菌株DNA PCR产物电泳图Fig.3 Electrophoretic profile of DNA PCR products of strains S00834-8 and IS00439-2

图4 S00834-8菌株（A）及IS00439-2菌株（B）的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of strains S00834-8（A）and IS00439-2（B）

表2 S00834-8菌株的同源性比较（%）Tab.2 Homology comparison of strains S00834-8（%）

表3 IS00439-2菌株的同源性比较（%）Tab.3 Homology comparison of strains and IS00439-2（%）

2.3益生菌生长特性

2.3.1时间特性 S00834-8 及IS00439-2 菌株分别于12 及8 h 达对数生长期，细胞浓度平稳，见图5。因此，S00834-8和IS00439-2菌株分别至少培养12和8 h才能获得最多活菌数。

图5 S00834-8和IS00439-2菌株的生长曲线Fig.5 Growth curve of strains S00834-8 and IS00439-2

2.3.2温度特性 S00834-8 菌株于34～40 ℃培养的A600分别为1.993、1.993、2.412、1.993、1.945，IS00439-2菌株的A600分别为1.390、1.771、1.409、1.389、1.343。S00834-8 及IS00439-2 菌株分别于37 和36 ℃的A600最大，因此，确定37和36 ℃分别为S00834-8及IS00439-2菌株的最适培养温度。

2.3.3酸碱特性 S00834-8菌株在pH为5.5～8.0范围内的A600分别为2.116、2.241、2.016、1.969、1.962和1.946，IS00439-2 菌株的A600分别为1.016、1.112、1.208、1.383、1.469和1.456。S00834-8及IS00439-2菌株分别于pH 6.0和7.5时A600最高，表明pH 6.0和7.5分别为S00834-8和IS00439-2菌株生长的最适pH。

2.3.4耐酸耐胆盐特性 S00834-8及IS00439-2菌株pH 为3.5 时，菌浓度超过pH 7.0 时的半数，表明其具有良好的耐胃酸能力。S00834-8 及IS00439-2 菌株于1.5%、1.0%、0.5%、0.3%胆盐中时，菌浓度均超过无胆盐组菌浓度的一半，表明其具有良好的耐胆汁能力。见表4。

表4 益生菌对胃酸及胆盐的耐受能力（A600）Tab.4 Resistance of probiotics to gastric acid and bile salt（A600）

2.3.5抗生素耐受性 S00834-8 菌株对β-内酰胺类抗生素中的哌拉西林中度敏感，其他药物不敏感；对喹诺酮类抗生素中的左氟沙星敏感，诺氟沙星中度敏感，环丙沙星不敏感；对氨基糖苷类抗生素中的阿米卡星和庆大霉素中度敏感，链霉素敏感；对四环素类抗生素中的四环素中度敏感；对氯霉素类抗生素中的氯霉素敏感。 IS00439-2 菌株对β-内酰胺类抗生素中的哌拉西林敏感，头孢呋辛中度敏感，其他药物不敏感；对喹诺酮类抗生素中的左氟沙星中度敏感，诺氟沙星敏感，环丙沙星不敏感；对氨基糖苷类抗生素中的阿米卡星和庆大霉素不敏感，链霉素敏感；对四环素类抗生素中的四环素中度敏感；对氯霉素类抗生素中的氯霉素敏感。见表5。

表5 抗生素耐受性试验结果Tab.5 Results of antibiotic resistance test

3 讨论

副干酪乳酸杆菌亚种属于乳杆菌属中的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）群，是从干酪乳酸杆菌中分离出的一个新的亚种，主要应用于食品发酵、肉类储藏和生物工程中［12］。副干酪乳酸杆菌不仅能够产生有机酸、双乙酰和过氧化氢，还能产生抑菌蛋白类活性物质细菌素。机体内副干酪乳酸杆菌亚种可促进产生IL-10、减少分泌IFNγ 和IL-4，并降低T 细胞数量，从而抑制免疫反应，减少炎性反应［12-15］。枯草芽孢杆菌是一种饲用微生物添加剂，能够提高饲料的适口性，改善胃肠道菌群区系，具有强大的抑菌性能，从而增强免疫力，激活肠道内的淋巴系统，促进免疫细胞的生成，且对动物无危害［16-18］。枯草芽孢杆菌还可产生蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、脂肪酶和麦芽糖酶等蛋白质，从而促进动物肠道对饲料的消化吸收［19-20］。

微生物制剂需经由口腔进入消化道，并在经过胃液和胆汁后才能在肠道定植发挥作用。因此，S00834-8 和IS00439-2 菌株作为微生物制剂的候选菌株，需进行耐酸耐胆盐测定。本研究结果表明，在pH 为3.5 和胆汁浓度为1.5%的条件下，S00834-8和IS00439-2 菌株仍保持较高的活菌数，表明其可定植在肠道发挥作用，这与其他相关研究的结果一致［21-22］。本研究结果显示，在37 ℃，pH 为6.0的环境中培养12 h后，S00834-8菌株进入对数生长期，生长情况良好，与文献［11］的研究结果一致。IS00439-2 菌株在8 h 达对数生长期，在36 ℃，pH 为7.5 的环境中生长情况良好，与文献［23］的研究结果一致。

根据美国SCLA 抗微生物敏感性试验执行标准M100进行菌株耐药性判定，结果显示，2株益生菌均对β 内酰胺类抗生素和青霉素类抗生素具有耐药性，但S00834-8菌株对氨基糖苷类抗生素（阿米卡星）敏感，IS00439-2 菌株对该药具有耐药性。S00834-8菌株的检测结果与尹珺伊等［24］对干酪乳酸杆菌抗生素耐受性的检测结果相符，部分结果不同可能是由于菌种属于同属不同种，微生物自身携带的耐药基因不同所导致的；IS00439-2 菌株的检测结果与高娟娟等［25］对枯草芽孢杆菌抗生素耐受性检测结果相符。

综上所述，本研究从鹅粪便中分离获得了副干酪乳酸杆菌亚种耐受型H S00834-8和枯草芽孢杆菌KA9 IS00439-2 益生菌，其对抗生素均具有不同程度的耐受性，有望与抗生素联合应用于动物相关疾病的治疗。