羧化壳聚糖在猪精液常温保存中抗氧化及抗菌作用研究

摘" " 要：为探索羧化壳聚糖（carboxymethyl chitin， CMCS）在猪精液常温保存过程中的抗氧化及抗菌作用，采集某猪场杜洛克品系公猪不同批次精液，并在常温条件下保存，第0天和第3天添加3种浓度CMCS（0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1），分别测定其对精子活力、总抗氧化能力（T-AOC）、活性氧水平（ROS）、丙二醛浓度（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性影响，筛选确定CMCS的最佳添加浓度;同时对所有批次精液进行细菌分离鉴定并测定CMCS抗菌效果。结果表明，与空白对照相比，在常温保存过程中，添加0.05 mg·mL-1CMCS可显著提高精子活力及T-AOC、CAT、SOD、GSH-PX抗氧化活性（Plt;0.05），降低ROS和MDA氧化指标（Plt;0.05）。另外，从采集的精液中分离出3株革兰氏阴性细菌，16SrDNA测序分析结果显示，3株细菌与变形杆菌参考菌株相似性最高，分别为99.93%、100%、99.79%，并且0.05 mg·mL-1壳聚糖添加组可显著降低猪精液常温保存中的细菌含量（Plt;0.05）。综上，CMCS在猪精液常温保存过程中的适宜添加浓度为0.05 mg·mL-1，该浓度CMCS可有效提高猪精液常温保存过程中的抗氧化性及抗菌活性。研究结果可为CMCS在猪精液常温保存过程中的应用提供理论依据。

关键词：羧化壳聚糖;猪精液;常温;保存;抗氧化;抑菌

中图分类号： S826" " " "文献标识码： A" " " "DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2024.12.010

Effects of Carboxymethyl Chitin on the Antioxidant and Antibacterial Properties in Boar Semen during Normal Temperature Preservation

TANG Peijuan1， SUN Jiuying2， DOU Shuhao1， LI Xinlei2， SUN Yingfeng2， FU Yongli1

（1. Tianjin Agricultural Development Service Center， Tianjin 300061， China; 2. College of Animal Science and Animal Medicine， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China）

Abstract： To explore the antioxidant and antibacterial effects of carboxymethyl chitosan （CMCS） in boar semen during normal temperature， different batches of Duroc male boar semen were collected from pig farms. The total antioxidant capacity（T-AOC）， reactive oxygen species（ROS）， malondialdehyde（MDA） content， catalase（CAT）， superoxide dismutase （SOD）， and glutathione peroxidase （GSH-PX） activity were determined on day 0 and day 3 under room temperature storage conditions in three CMCS concentrations （0.05 mg·mL-1， 0.10 mg·mL-1， 0.15 mg·mL-1） groups for determination the optimal concentration. Simultaneously， bacterial isolation and identification were performed on all batches of semen， and the antibacterial effect of CMCS was further analyzed. The results showed that compared with the blank control， adding 0.05 mg·mL-1 CMCS could significantly increase sperm motility and antioxidant activities such as T-AOC， CAT， SOD， GSH-PX （Plt;0.05）， while it could reduce oxidative indicators such as ROS and MDA （Plt;0.05）during room temperature storage， suggestting that 0.05 mg·mL-1CMCS was the appropriate concentration inboar semen. Three strains of Gram negative bacteria were isolated from some batches of semen， and the 16S rDNA sequencing analysis showed that the bacteria were highest similarity with the reference strain of Proteus， with 99.93%， 100%， and 99.79%， respectively. Moreover， 0.05 mg·mL-1 CMCS could significantly reduce the bacterial content during room temperature storage （Plt;0.05）. In conclusion， the appropriate concentration of CMCS in normal temperature storage of pigs is 0.05 mg · mL-1， which can effectively improve the antioxidant and antibacterial activities of pigs in normal temperature storage. The results provide a theoretical basis for the application of CMCS in normal temperature storage of pigs.

Key words：CMCS; boar semen; room temperature; stored; antioxidant; antibacterial

目前人工授精技术在提高生猪生产效率、优化种群遗传结构和疾病防控方面展现出了巨大潜力，已经被广泛应用，其中精液常温保存技术是人工授精的重要环节[1]。猪精液常温保存过程中易受多种因素影响，如时间、温度、渗透压，抗氧化水平、微生物繁殖等，其中精子自身代谢会产生大量活性氧累积，使精子质膜脂质过氧化，破坏细胞膜，线粒体、DNA等，影响其受精能力及子代品质[2]。此外，由于精液的采集和处理没有进行严格的无菌操作，易出现微生物污染的情况，对公猪精液质量会产生负面影响[3]。因此，筛选具有抗氧化应激且抗菌的添加剂对于提高精液保存质量和保证临床安全生产具有重要意义。

羧化壳聚糖（carboxymethyl chitin，CMCS）是一种改性的水溶性壳聚糖衍生物，具有无毒副作用和生物相容性，可以结合并清除羟自由基，具有较好的抗氧化性。张严伟等[4]研究表明，福瑞鲤饲喂羧化壳聚糖能够明显增强血浆中超氧化物歧化酶的活性，同时减少丙二醛水平。此外，CMCS对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率达90%以上，表现出高抗菌效率，是一种潜在的天然抗菌剂[5]。本试验旨在探讨CMCS 在猪精液常温保存过程中的抗氧化及抗菌作用，以期为CMCS在猪精液常温保存过程中的实际应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验精液

试验材料为天津地区某猪场杜洛克精液。

1.2 主要试剂

CMCS （纯度≥90%）为国内某公司产品，T-AOC、ROS、SOD、CAT、MDA、GSH试剂盒购自南京建成公司，琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、质粒提试剂盒为天根生化试剂有限公司产品，5× MLV buffer、dNTP、MLV、RandomPrimer等分子生物学相关试剂为TaKaRa公司产品。

1.3 仪器与设备

细菌培养箱、恒温水浴锅为天津泰斯特仪器有限公司，电子分析天平为上海精密仪器仪表有限公司，PCR 扩增仪、电泳仪和凝胶成像仪为BioRad公司产品。

1.4 CMCS溶液配制

准确称取2.5 g CMCS放入灭菌烧杯内，溶解于Modena稀释液中，并定容到500 mL，配制成5 mg·mL-1溶液，在无菌台过滤除菌，在4 ℃条件下保存，备用。

1.5 精液的稀释

将5 mg·mL-1CMCS溶液在水浴锅内预热到17 ℃，时间持续5 min，备用;取15 mL灭菌试管，分别取0.1、0.2、0.3 mL CMCS溶液与精液混合，定容至10 mL，配制成0.05、0.10、0.15 mg·mL-1浓度溶液，每个浓度重复3次，同时设置不添加CMCS空白对照组（CK）。所有处理组均放置17 ℃恒温箱中保存，每隔12 h缓慢摇动1次。

1.6 CMCS对精液品质的影响

1.6.1 精子活力的检测 在第0 天、第1天、第2天和第3天，分别从17 ℃恒温条件下保存的精液样本中取样，用显微镜在3个不同视野下观察精子的运动情况，测定并记录精子活力。

1.6.2 精液中抗氧化指标的检测 选择添加CMCS处理的第3天精液样品，每个浓度3次重复，检测精液样品的 MDA、T-AOC、SOD、CAT、ROS、GSH-PX指标。依据试剂盒的使用指南进行操作，并对测定的相应结果进行计算。

1.7 CMCS对精液中细菌含量的影响

对所有批次精液进行细菌分离纯化、革兰氏染色和16S rDNA 基因PCR扩增与测序分析，选择CMCS最佳添加浓度处理的精液，分别于添加处理的第1天、第2天、第3天进行平板法活菌计数，分析CMCS对精液中细菌含量的影响。

1.8 数据处理

本研究利用 IBM SPSS Statistics 软件对本试验数据进行单因素方差分析，数据结果以“均值±标准误”的形式展示，差异显著性的判定标准为Plt;0.05。

2 结果与分析

2.1 CMCS对猪精液中精子活力的影响

如表1所示，在添加CMCS的第0天，所有组的精子活力差异不显著（Pgt;0.05）; 在添加CMCS的第1天，与空白对照组（0 mg·mL-1）相比，0.05 mg·mL-1CMCS处理组的精子活力差异不显著（Pgt;0.05），0.10、0.15 mg·mL-1CMCS处理组的精子活力显著差异（Plt;0.05）;在添加CMCS的第2天，与空白对照组（0 mg·mL-1）相比，所有CMCS添加处理组的精子活力显著差异（Plt;0.05），并且0.05 mg·mL-1 CMCS处理组的精子活力最高;在添加CMCS的第3天，与空白对照组（0 mg·mL-1）相比，0.05、0.10 mg·mL-1CMCS处理组的精子活力差异显著（Plt;0.05），并且0.05 mg·mL-1 CMCS处理组的精子活力最高。

2.2 CMCS对猪精液相关氧化指标的影响

2.2.1 CMCS对猪精液中总抗氧化能力的影响 向猪精液中加入不同浓度CMCS，并在常温下保存3 d，检测其对总抗氧化能力（T-AOC）的影响，结果见图1。由图1可以看出，猪精液常温保存3 d，与空白对照组相比，0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1CMCS处理组的总抗氧化能力差异显著，并且0.05 mg·mL-1 CMCS处理组的效果最好。

2.2.2 CMCS对猪精液中丙二醛含量的影响 向猪精液中加入不同浓度CMCS，并在常温下保存3 d，检测其对丙二醛（MDA）含量的影响，结果见图2。由图2可以看出，与空白组相比，0.05、0.10、0.15 mg·mL-1CMCS处理组的MDA含量均显著下降（Plt;0.05），其中0.05 mg·mL-1 CMCS处理组的效果最好。

2.2.3 CMCS对猪精液中活性氧含量的影响 在猪精液中添加不同浓度CMCS，常温保存3 d，测定其对活性氧含量（ROS）的影响，结果见图3。由图3可以看出，与空白组相比，0.05、0.10、0.15 mg·mL-1 CMCS处理组的ROS水平均显著下降（Plt;0.05），其中0.05 mg·mL-1CMCS处理组的效果最好。

2.2.4 CMCS对猪精液中过氧化氢酶活性的影响 向猪精液中加入不同浓度CMCS，并在常温下保存3 d，检测其对过氧化氢酶（CAT）的影响，结果见图4。由图4可以看出，与空白组相比，0.05、0.10、0.15 mg·mL-1CMCS处理组的CAT活性显著增加（Plt;0.05），其中0.05 mg·mL-1CMCS处理组的效果最好。2.2.5 CMCS对猪精液中超氧化物歧化酶活性的影响 向猪精液中加入不同浓度CMCS，并在常温下保存3 d，检测其对超氧化物歧化酶（SOD）的影响，结果见图5。由图5可以看出，与空白组相比，0.05、0.10、0.15 mg·mL-1 CMCS处理组的SOD含量显著增高（Plt;0.05），其中0.05 mg·mL-1CMCS处理组的效果最好。

2.2.6 CMCS对猪精液中谷胱甘肽过氧化酶活性的影响 在猪精液中添加不同浓度CMCS，常温保存3 d，测定其对谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）活性的影响，结果见图6。由图6可以看出，与空白组相比，0.05、0.10、0.15 mg·mL-1 CMCS处理组的GSH-PX活性显著增加（Plt;0.05），其中0.05 mg·mL-1CMCS处理组的效果最好。

2.3 CMCS对猪精液中细菌含量的影响

2.3.1 猪精液中细菌的分离鉴定 对所有批次精液进行细菌分离鉴定并进行16SrDNA扩增测序分析。从采集的50份精液中分离出3株细菌，分别命名为A、B、C菌株，革兰氏染色镜检为革兰氏阴性菌（图7）。利用特异性引物进行16SrDNA扩增，3株细菌均能扩增出1 500 bp条带，与预期位置大小一致。将扩增产物克隆测序序列和Blast序列比对分析，结果表明，3株细菌均与变形杆菌参考菌株相似性最高，相似度分别为99.93%、100%、99.79%，并且遗传进化树显示，3株细菌处于同一大分支（图8）。

2.3.2 CMCS对猪精液中细菌的抑制作用 在含有细菌的猪精液中添加0.05 mg·mL-1 CMCS，常温保存3 d，每天测定其对细菌含量的影响，结果见图9。由图9可知，精液保存至第1天、第2天、第3天时，与空白对照组相比，0.05 mg·mL-1CMCS处理均能显著降低猪精液中细菌含量（Plt;0.05）。这表明0.05 mg·mL-1 CMCS处理能够抑制细菌增长。

3 讨论与结论

3.1 讨论

近年来，随着规模化养猪的发展，猪人工授精技术在推动产业降本增效和优良品种推广应用方面表现出了积极的现实意义，其中因常温保存技术成本低及易操作特点，在临床应用中得到了大力推广，但在猪精液常温保存过程中，精子会产生ROS蓄积，进而发生氧化损伤，导致精子活力下降或死亡，影响精液品质，降低母猪受胎率[5]。因此，在精液常温保存中，为了防止过多的活性氧（ROS）引起氧化应激，并保护和提升精子的活力，在稀释精液或使用稀释粉时，添加抗氧化剂是一项关键措施[6]。研究报道，CMCS具有清除氧自由基功能，是一种理想的天然抗氧化剂[4，7]。因此，探索CMCS对猪精液常温保存效果研究，可为下一步开发出稳定高效的CMCS稀释配方提供理论依据，以期提升猪精液常温保存质量。

T-AOC是反映生物体防御氧化损伤能力的重要指标，T-AOC 活性越强，抵抗氧化损伤能力越强;MDA含量是精子膜脂质过氧化反应的产物之一，含量越高，说明精子各部位损害越大。本研究结果表明，添加CMCS能够显著增强总抗氧化能力（T-AOC），并有效降低丙二醛（MDA）含量，说明适量添加CMCS能在一定程度上清除自由基，这与王骞等[8]研究结果基本一致。其次，ROS是细胞需氧代谢过程中产生的不稳定代谢产物，主要包括SOD、CAT 和 GSH-PX，是实验室检测细胞代谢系统中抗氧化水平重要指标，如左旋肉碱能促进SOD、GSH-PX 和乳酸脱氢酶（LDH）的合成，发挥抗氧化作用[9]。本研究结果发现，在整个常温保存过程中，添加CMCS可以显著降低 ROS活性，提高SOD、CAT 和 GSH-PX活性。因此， CMCS能在精液常温保存环境中发挥抗氧化能力，提升精子保存效果。

壳聚糖对真菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都表现出抗菌活性，已被广泛应用于抗菌领域，其中化学改性可显著提高壳聚糖抗菌活性，例如羧甲基化改性不仅可以提高壳聚糖的水溶性，还能扩大其抗菌谱。使用不同类型的壳聚糖进行体外抗枯草杆菌和大肠杆菌试验，结果发现，水溶性壳聚糖的抗菌效能优于高分子量壳聚糖[10]。

3.2 结论

本研究在常温条件下添加不同浓度CMCS，并在不同时间观察不同处理组的细菌含量变化情况，结果显示，添加CMCS的处理组有明显的抑菌效果，这与谢东淇[11]研究结果相似。另外，本课题组前期研究报道，天津地区公猪精液中细菌携带比例高达38.87%（192/494），其中变形杆菌属（Proteus）最高，为26.53%（52/192），并且猪对四环素、林可霉素等已产生高度耐药性[12]。本研究对精液中细菌进行了分离鉴定，遗传进化树显示，3株细菌均为变形杆菌属成员，原因推测为猪精液在采集过程中受到污染，这提示人们应注意采集规范化操作。同时，添加CMCS的处理能够抑制细菌增长。由于本研究的样品数量相对较少，建议在后续研究中加大样品的数量以及跟踪母猪临床繁殖效果，以进一步完善评估CMCS在精液中应用效果。

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作者简介：唐佩娟（1979—），女，天津人，兽医师，硕士，主要从事畜禽养殖生产技术推广研究。

通讯作者简介：付永利（1964—），男，天津人，高级畜牧师，主要从事畜牧兽医技术推广服务研究。