镉胁迫下施加生物炭对丛枝菌根真菌和三叶草生长的影响

摘" " 要：为提升丛枝菌根（AM）真菌在重金属污染土壤中的适应能力与修复潜能，以三叶草作为宿主，分别用无菌土壤（CK）和等比例添加生物炭（T）作为基质对AM真菌进行扩繁培养，通过设置不同浓度镉（Cd）胁迫（Cd0：0、Cd1：10 mg·g-1、Cd2：20 mg·g-1），研究Cd胁迫下添加生物炭对AM真菌和三叶草生长的影响。结果表明，Cd胁迫下菌根中泡囊和菌丝分布较为稀疏，随着Cd胁迫浓度的增加，CK组的菌根侵染率从51.45%降低到15.44%，孢子密度从22.53个·g-1降低到10.20个·g-1。施加生物炭能显著提高菌根侵染率和孢子产量，T组的苗根侵染率在3种浓度Cd胁迫下较对应CK组分别提高30.75%、45.66%、119.42%，孢子密度分别增加4.31%、9.24%、55.20%。添加生物炭后，三叶草的根长、株高、生物量也显著提升，但根冠比与是否添加生物炭相关性不显著。综上，Cd胁迫下施加生物炭能显著促进菌根侵染，提高AM真菌孢子密度，并且减轻Cd对三叶草生长的毒害，有利于AM真菌的扩繁。

关键词：镉胁迫;丛枝菌根真菌;生物炭;扩繁;菌根率

中图分类号：X53" " " " "文献标识码：A" " " " " "DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2024.12.006

Effects of Biochar Application on the Growth of Arbuscular mycorrhizal Fungi and Clover under Cadmium Stress

WANG Xiaobing， MENG Shilong， XU Luping

（Xinxiang University， School of Civil Engineering and Architecture， Xinxiang， Henan 453003， China）

Abstract：To improve the adaptability and remediation potential of arbuscular mycorrhizal （AM） fungi in heavy metal contaminated soils， clover was used as the host plant to propagate AM fungi with axenic soil （CK） and biochar added in equal proportion （T） as the medium respectively， and different concentrations of cadmium stress （Cd0： 0， Cd1： 10 mg·g-1， Cd2： 20 mg·g-1） was set to study the effect of adding biochar on the growth of AM fungi and clover under cadmium stress. The results showed that the distribution of vesicles and hyphae in mycorrhiza was sparser under Cd stress. With the increase concentration of Cd stress， the mycorrhizal infection ratio in the CK groups decreased from 51.45% to 15.44%， and the spore density decreased from 22.53 to 10.20 per gram. Biochar could increase the mycorrhizal infection ratio and spore production significantly. Under three concentrations of Cd stresses， the mycorrhizal infection ratio of T groups increased by 30.75%， 45.66% and 119.42% compared with corresponding CK groups， meanwhile， the spore density increased by 4.31%， 9.24% and 55.20% respectively. The root length， plant height， and biomass of clover also significantly increased， while the root-to-shoot ratio was not significantly related to whether biochar was added. In conclusion， the application of biochar can significantly promote mycorrhizal infection， increase the spore density of AM fungi， and reduce the toxicity to clover growth under cadmium stress， which should be beneficial to the" propagation of AM fungi.

Key words： cadmium stress; arbuscular mycorrhizal fungi; biochar; propagation; mycorrhizal ratio

生物炭是生物残体在缺氧条件下经高温慢热解产生的富含碳素的固态物。生物炭属于生态友好型碳质材料，具有表面积大、多孔结构复杂、表面官能团丰富等特性，在土壤改良领域受到研究学者的广泛关注[1]。生物炭内部含有丰富的碳、氢、氧、氮等常量元素，根据制成原料的不同，生物炭含有钙、钾、铁、锰等微量元素，可为植物生长提供充足的营养[2]。生物炭作为一种新型环境功能材料，具有较高的孔隙度和较大的比表面积，可以吸附并固定土壤中重金属离子，在农田重金属污染治理方面具有广阔的前景[3]。生物炭在结构方面所呈现出来的细微孔隙结构分布较为复杂，该构造的表面积占比较大，在融入土壤表层后，增加了表层微生物的栖息场所，有利于微生物的生存和繁衍，可以有效提高土壤中有益菌群的数量[4]。

丛枝菌根（arbuscular mycorrhiza fungi，AM）真菌是在土壤中广泛存在的土壤微生物，可与植物建立互惠共生关系，并促进植物生长。AM真菌与植物建立共生体系后，能够促进宿主植物对游离氨基酸等氮源的吸收，对植物的生长发育具有良好的促进作用[5]。菌根内部的共生结构，如丛枝菌丝和泡囊等，通过过滤、固持将部分重金属阻滞于根部，或者通过螯合作用与重金属形成螯合体，从而减少重金属通过植物根系向植物地上器官转运，进而有效缓解重金属对植株的毒害[6]。此外，AM真菌可促进宿主植物对矿质元素的吸收，扩大植物根系面积，改变根际理化性状、宿主植物体内抗氧化酶活性和宿主植物相关基因表达量[7- 8]，从而缓解重金属对宿主植物的毒害。

近年来，菌根技术被广泛用于修复土壤重金属污染，由于AM真菌的生长和活动对环境条件依赖性强，重金属会对AM真菌的生长产生抑制，使其难以侵染植物根系，从而影响共生体系的形成和发展[9]。为探究施加生物炭能否减轻重金属对AM真菌和宿主植物的毒害，进而提升其侵染率和孢子产量，本试验采用盆栽培养法，以三叶草和摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae）为试验材料，设置生物炭组和对照组，分别施加不同浓度的镉（Cd）胁迫，通过检测菌根侵染率、孢子密度和三叶草生长状况，研究Cd胁迫下施加生物炭对AM真菌扩繁的影响，进而为生物炭和AM真菌在土壤重金属污染治理中的应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌种为Funneliformis mosseae，购自长江大学根系研究所。培养宿主为红三叶草，基质为灭菌后的赤玉土和400 ℃下制备的玉米秸秆生物炭，粒径范围为1～3 mm。

1.2 试验设计

本试验采用三叶草盆栽培养法对AM真菌进行扩繁培养，于2023年12月上旬开始种植。将三叶草种子和花盆分别用0.5%高锰酸钾溶液浸泡20 min，并用清水冲洗干净。将无菌土壤和生物炭等量混合，取2 kg添加至花盆内，每个花盆添加50 g AM菌剂，并将其与土壤均匀混合，保证花盆中土壤平整，每个花盆播种3 g三叶草种子，做好标记并随机放置，记作T组。通过向盆中加入Cd浓度为0、100 mg·L-1、200 mg·L-1的CdCl2溶液200 mL来模拟0、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1的土壤Cd胁迫，分别记作Cd0、Cd1、Cd2。同时，设置对照组（CK），培养基质为2 kg无菌土壤，AM菌剂、播种量和Cd胁迫与T组相同。以上每组重复3盆。

采取室内培养方式，培养温度保持在25 ℃，使用植物培养补光灯，保证每个试验组都能获得充足的光源，补光周期为8：00—20：00。培养过程中，按时浇水，每2周补充1次Hoagland营养液，及时清理花盆中的异物。2024年3月中旬，采集样本后进行试验。

1.3 试验方法

1.3.1 菌根侵染率测定 使用台盼蓝染色法对菌根进行染色，并测定侵染率[10]。称取1～2 g新鲜的根系，清洗后，切成1～2 cm小段，置于组织包埋盒中。首先，将组织包埋盒放入含10%氢氧化钾溶液的500 mL烧杯中，经90 ℃水浴处理30 min。倒掉烧杯中的液体，用镊子夹取组织包埋盒，使用蒸馏水清洗干净。将取得的样本切片置于盛有2%盐酸溶液的烧杯内浸泡，常温条件下静置5～10 min。倒掉盐酸溶液，用镊子夹住包埋盒，用蒸馏水冲洗干净。将包埋盒放入装有0.05%台盼蓝的烧杯内，放入染色浴锅中染色10～30 min。处理完染液后，再次使用镊子夹住包埋盒，用蒸馏水冲洗。最后，将包埋盒浸泡在装有脱色液的烧杯中脱色处理2～3 d。

随机选取30～50个根段进行制片，每片上含有3～5个根段。在显微镜下观察菌根侵染情况，每个玻片观察10个视野，共观察100个视野。使用0—1计数法统计侵染的根段数量，计算菌根侵染率。

1.3.2 AM真菌孢子密度测定 称取10 g风干土壤样品，用水浸泡30 min，搅拌均匀，然后将土壤溶液过双层分样筛（上筛20目，下筛400目），反复冲洗待测样品，并过筛3次，将筛出物收集到试管中。滴加台盼蓝染色剂，放在90 ℃水浴锅进行染色30 min，然后洗去染色剂，将筛出物放在培养皿中，并在显微镜下观察和计数[11]。

1.3.3 三叶草生长情况测定 用游标卡尺测量根长和株高，根长为根茎连接处到最长根根尖的长度，株高为土壤以上的茎秆到植物最顶端的高度。测量时，三叶草样品要处于平直状态，以免测量数据失真。将净过的三叶草样品地上部分和地下部分剪开，在90 ℃条件下烘干至质量不再发生变化，分别称量干质量。地下生物量与地上生物量之比为根冠比，以百分比表示。

1.4 数据处理

试验数据利用Microsoft Excel 2019软件整理并制作图表，利用R 4.4.1软件进行单因素方差分析，用Duncan's新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 菌根侵染率

图1为菌根侵染情况，经过台盼蓝染色后，菌丝和泡囊均被染成蓝色，在显微镜下可以清晰看到。由图1-A可见，大量的泡囊和菌丝存在于根系中;由图1-B和图1-C可见，菌根侵染情况依次减弱，泡囊和菌丝的分布较为稀疏;由图1-D可见，明显泡囊分布更多，菌丝更密集;由图1-E和图1-F可见，泡囊、菌丝数量更多。

由图2可知，三叶草的菌根侵染率范围为15.44%～67.28%，添加生物炭可显著增加AM真菌对三叶草的菌根侵染。Cd0-T组的菌根侵染率为67.28%，显著高于Cd0-CK组。施加Cd胁迫，对于三叶草菌根侵染有较大的影响。Cd1-T组的菌根侵染率为50.41%，显著高于Cd1-CK组，并且与Cd0-CK组差异不显著。Cd2-CK组的菌根侵染率下降至15.44%，显著低于其他组，Cd2-T组的菌根侵染率下降至33.88%，与Cd1-CK组差异不显著。

2.2 孢子密度

由图3可知，随着Cd胁迫浓度的增加，AM真菌孢子密度呈减小趋势。Cd1-CK组和Cd2-CK组的孢子密度为17.97、10.20个·g-1，分别较Cd0-CK组减少20.24%、54.73%。Cd0-T组的孢子密度为23.50个·g-1，略高于Cd0-CK组，但是差异不显著。Cd1-T组和Cd2-T组的孢子密度分别为19.63、15.83个·g-1，较Cd1-CK组和Cd2-CK组分别增加9.24%、55.20%。

2.3 三叶草根长

由图4可知，不同处理的三叶草根长变化趋势与菌根侵染率结果相似。Cd0-CK组的三叶草根长为2.04 cm，Cd0-T组的三叶草根长为2.37 cm，Cd0-T组根长显著大于Cd0-CK组，相较Cd0-CK组增加16.18%。Cd1-CK组的根长为1.84 cm，比Cd0-CK处理减少9.80%，而Cd1-T组的根长为2.10 cm，与Cd0-CK组差异不显著。Cd2-CK组和Cd2-T组的根长相较于Cd0-CK和Cd0-T组分别减少22.55%、23.21%，T组的根长显著高于CK组。结果表明，Cd胁迫下三叶草的根长受抑制，生物炭的添加对3种处理的三叶草根系生长产生了积极影响。

2.4 三叶草株高

本试验中，Cd0-CK、Cd1-CK、Cd2-CK组的株高分别为8.02、6.53、5.74 cm，Cd0-T、Cd1-T、Cd2-T组的株高分别为8.78、8.16、6.68 cm，添加生物炭对三叶草的株高有显著促进作用（图5）。Cd0-T组的株高较Cd0-CK组增加9.47%。随着Cd胁迫浓度的增加，2组株高下降程度不同。Cd1-CK组和Cd1-T组的株高分别比Cd0-CK组和Cd0-T组降低18.58%、7.06%，Cd2-CK组和Cd2-T组的株高分别比Cd0-CK组和Cd0-T组降低28.43%、23.92%。结果表明，Cd胁迫下T组的株高降低幅度明显小于CK组。

2.5 三叶草生物量

由表1可知，不同处理的三叶草地上生物量和地下生物量均有明显变化。地上生物量的变化幅度较小，Cd0和Cd1处理下T组和CK组差异均不显著。Cd1-CK组显著小于Cd0-T组和Cd0-CK组，生物量分别降低了3.46、3.09 mg。Cd2-T组的生物量比Cd2-CK组提高3.80 mg。地下生物量与地上生物量变化趋势相似，主要区别是T组的地下生物量与地上生物量在相同Cd胁迫下均显著高于CK组，其中Cd0处理提高10.16%，Cd1处理提高13.24%，Cd2处理提高19.72%。

随着Cd胁迫浓度的增加，三叶草的根冠比呈降低趋势，Cd0-T组最大，Cd2-T组最小，但是所有处理的根冠比差异均不显著。由此说明，Cd胁迫下添加生物炭并未对三叶草的根冠比产生影响。

3 讨论与结论

3.1 讨论

菌根侵染率是反映AM真菌与宿主植物之间是否存在共生关系的重要指标，菌根侵染率越大，说明AM真菌与宿主的共生关系越好[12]，越有利于AM真菌生长和繁殖。此外，AM真菌能够增强宿主植物的抗逆性，菌根定殖率越高，植物抵抗不良环境能力越强[13]。孢子是AM真菌的主要繁殖体，具有较稳定的形态结构，能够在土壤中长期存在。土壤中AM真菌孢子密度是影响其侵染和繁殖的重要因素[14]。重金属会对AM真菌的生长和定殖产生不利影响，土壤中Zn、Cd、Pb等重金属含量较高时，AM真菌的侵染率和丛枝丰度较低[15]。重金属对AM真菌的产孢能力也具有明显的抑制作用，随着重金属含量的增加，AM真菌的孢子密度显著降低[16-17]。本试验中，Cd胁迫下菌根中泡囊和菌丝的分布较为稀疏，菌根侵染率和孢子密度显著降低。本试验结果与上述研究结果一致，证明了Cd对试验菌株的活性和根系的侵染具有抑制作用。

生物炭中富含羟基、羧基、羰基等官能团，具有重金属的结合位点，可与重金属络合产生沉淀，从而使重金属从可溶相向不溶相转变，降低重金属的生物有效性[18]。本试验中，Cd胁迫下T组菌根形成的泡囊、菌丝数量更多，并且菌根侵染率和产孢量均显著高于CK组。Cd2处理下施加生物炭与Cd1处理下未施加生物炭的菌根侵染率持平，说明施加生物炭可以进一步减轻重金属对 AM真菌活性的抑制。研究表明，施加生物炭能够促使AM真菌分泌球囊霉素相关土壤蛋白（GRSP），进而增强对土壤重金属的固化能力，降低土壤重金属流动性[19]，有利于AM真菌的繁殖和侵染。

AM真菌不能在普通培养基中独立生长，其生长和繁殖对宿主植物的生长状况和营养分配具有很强的依赖性。较长的根长意味着植物根系在土壤中分布更广泛，占据的空间更大，能与更多AM真菌孢子及菌丝接触，从而增加了被侵染的机会[20]。株高与植物接收光照的能力有关，在一定程度上反映了光合作用能力的大小[21]。生物量和根冠比则反映了植物对有机物的分配状况。重金属会破坏植物根细胞的结构和功能，影响细胞的分裂和伸长，从而抑制根的生长[22]。重金属被植物吸收后，通过木质部转运至地上部，通过韧皮部进行再分配，其在植物体内大量累积会导致植物地上部分生长发育受到抑制[23-24]。过量的重金属还会影响植物叶片中叶绿素的合成，降低光合作用效率，减少植物的生物量积累[25]。本试验中，施加生物炭组的根长、株高和生物量比CK组有所增加，并且Cd1和Cd2处理下各组生长指标与Cd0处理下CK组持平，说明Cd胁迫下施加生物炭能减小对宿主植物的毒害，为AM真菌的生长和繁殖创造有利条件。各试验组的根冠比变化不显著，说明Cd胁迫下三叶草能够调节有机物的分配，总体上使地上部分和地下部分保持均衡。

3.2 结论

综上所述，Cd胁迫下施加生物炭能显著促进菌根侵染，提高AM真菌孢子密度，并且减轻Cd对三叶草生长的毒害，有利于AM真菌的扩繁。在土壤重金属污染治理中，可以将AM真菌和生物炭相结合，促进AM真菌共生体系的建立，进一步增强植物对环境胁迫的抵抗力。

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基金项目：河南省科技攻关项目（232102111008）

作者简介：王晓冰（1990—），男，河南登封人，讲师，博士，主要从事土壤生态修复研究。