老年乳腺癌患者癌组织中YTHDF1、E2F8 蛋白表达变化及与预后的关系

冯铎，徐菲，吴晓琴，邹天辉，刘尧，王寰昱

华中科技大学协和深圳医院甲乳外科，广东深圳518052

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，全球每年新发病例达230万例［1］。由于治疗的耐受性差、合并其他基础疾病及机体功能退化等因素，老年乳腺癌患者预后较差［2］。改良根治术是治疗乳腺癌最常用的术式，但术后有10%～30%的患者发生局部复发或远处转移［3］。深入研究影响老年乳腺癌患者的预后因素对早期干预具有重要意义。N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1（YTHDF1）具有RNA结合活性和N6甲基腺苷（m6A）修饰活性，参与信使RNA 的稳定性及翻译起始的调节［4］。近年研究发现，YTHDF1 能增强肿瘤细胞无氧糖酵解，促进卵巢癌［5］、宫颈癌［6］等恶性肿瘤的增殖及转移，是潜在的肿瘤预后相关标志物。E2F 转录因子8（E2F8）属于转录因子家族成员，参与调节细胞周期、胚胎发育及血管生成等多种生物学过程［7］。研究表明，在黑色素瘤、肝癌等恶性肿瘤中E2F8表达上调，其能促进肿瘤细胞由G1到S期的转换，导致肿瘤过度增殖及患者不良预后［8］。目前老年乳腺癌中YTHDF1、E2F8 的表达与预后的关系尚不清楚。本研究观察老年乳腺癌患者癌组织中YTHDF1、E2F8 蛋白表达变化，探讨二者与患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017 年1 月—2018 年2 月就诊于本院的146 例老年乳腺癌患者，年龄60～81（68.59 ± 5.25）岁；病理类型：浸润性癌99 例，非浸润性癌47例；肿瘤最大径：≤2 cm 94例，＞2 cm 52例；合并淋巴结转移37 例；TNM 分期：Ⅰ期88 例，Ⅱ期58 例；组织学分级：Ⅰ级40 例，Ⅱ级52 例，Ⅲ级54例；雌激素受体（ER）阳性67 例；孕激素受体（PR）阳性65例；人表皮生长因子受体2（HER-2）阳性35例。纳入标准：老年女性，年龄＞60 岁；均接受乳腺癌改良根治术治疗，术后病理检查明确诊断为乳腺癌；单侧乳腺癌；首次诊治，既往无手术及放化疗治疗；病历及随访资料完整。排除标准：继发性乳腺癌；多中心病灶或双侧乳腺癌；合并远处转移；合并其他恶性肿瘤；合并严重肝肾等脏器衰竭；合并精神障碍性疾病、不能或不愿接受术后规范化治疗及不能配合随访的患者。本研究经医院伦理委员会审核通过。

1.2 YTHDF1、E2F8蛋白表达检测 采用免疫组化染色法。术中取癌组织和癌旁组织（距离肿瘤边缘＞2 cm，经病理检查明确为正常乳腺组织），以石蜡包埋，5 μm 厚切片，脱蜡和水化，柠檬酸缓冲液中抗原修复，100 ℃ 3 min，山羊血清封闭后一抗（兔抗人YTHDF1、E2F8 多克隆抗体，购自美国Invitrogen 公司）4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h 后显色液显色，苏木精染色后脱水透明化，中性树胶封片。免疫组化染色相关试剂均购自北京博奥森生物科技有限公司，显微镜购自日本奥林巴斯公司。由两位病理医生进行免疫组化染色评定。染色面积评分：肿瘤染色面积≤10%计0 分，11%～25%计1 分，26%～50%计2 分，51%～75%计3 分，＞75%计4 分。染色强度评分：未染色计0分，淡黄色染色计1分，棕黄色染色计2 分，深棕褐色染色计3 分。以上两项评分乘积≥4为阳性。

1.3 术后治疗 术后参考2009 年美国国立综合癌症网络指南［9］，中低危乳腺癌患者予多西他赛、环磷酰胺联合化疗方案，化疗4周期，化疗期间联合曲妥珠单抗治疗；高危患者加铂类药物。患者均接受50 Gy 剂量的全乳及患侧胸壁放疗，瘤床增加10 Gy 放射剂量，总疗程3～4 周，分次剂量2 Gy。ER、PR 阳性乳腺癌患者，术后予以芳香化酶抑制剂依西美坦或来曲唑治疗。

1.4 随访及预后评价 患者出院后，以门诊复诊和电话回访的方式对其进行随访，每3～6 个月随访1次，共随访5 年。随访至2023 年2 月1 日，记录患者随访期间肿瘤复发、转移以及死亡的时间。无进展生存期定义为患者自出院至肿瘤复发、转移或死亡的时间。

1.5 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验；用Spearman秩相关分析乳腺癌组织YTHDF1 与E2F8 表达的相关性；用Kaplan-Meier 法分析YTHDF1、E2F8 蛋白表达与患者无进展生存预后的关系；Cox 回归分析老年乳腺癌患者无进展生存预后的影响因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织与癌旁组织YTHDF1、E2F8 蛋白表达比较 乳腺癌组织YTHDF1、E2F8 棕黄色阳性染色主要定位于细胞核。乳腺癌组织中YTHDF1、E2F8 蛋白阳性表达率分别为79.45%（116/146）、74.66%（109/146），癌旁组织中YTHDF1、E2F8蛋白阳性表达率分别为11.64%（17/146）、8.22%（12/146）。乳腺癌组织中YTHDF1、E2F8 蛋白阳性表达率高于癌旁组织（P均＜0.05）。

2.2 乳腺癌组织中YTHDF1与E2F8蛋白表达的相关性 Spearman 秩相关分析结果显示，乳腺癌组织中YTHDF1与E2F8蛋白表达呈正相关（r=0.706，P＜0.05）。

2.3 YTHDF1、E2F8蛋白表达与老年乳腺癌患者临床病理特征的关系 TNM 分期Ⅱ期、肿瘤最大径＞2 cm、合并淋巴结转移老年乳腺癌患者癌组织中YTHDF1、E2F8蛋白阳性表达率高于TNM分期Ⅰ期、肿瘤最大径≤2 cm、无淋巴结转移的癌组织（P均＜0.05）。见表1。

表1 YTHDF1、E2F8蛋白表达与老年乳腺癌患者临床病理特征的关系［例（%）］

2.4 YTHDF1、E2F8蛋白表达与老年乳腺癌患者无进展生存预后的关系 随访6～60（52.74 ± 7.18）个月，32例患者发生肿瘤进展。YTHDF1蛋白阳性、阴性患者5 年无进展生存率分别为73.68%（84/114）、93.75%（30/32）；E2F8蛋白表达阳性、阴性患者5年无进展生存率分别为71.70%（76/106）、95.00%（38/40）。YTHDF1、E2F8 蛋白表达阳性患者5 年无进展生存率低于其蛋白表达阴性患者（P均＜0.05）。

2.5 老年乳腺癌患者无进展生存预后的影响因素 以老年乳腺癌患者随访中是否发生进展为因变量（1=进展，0=无进展，t=时间），以各临床病理特征及YTHDF1、E2F8 蛋白表达为自变量，单因素及多因素Cox回归分析结果显示，TNM 分期Ⅱ期、合并淋巴结转移、YTHDF1 蛋白阳性表达、E2F8 蛋白阳性表达是老年乳腺癌患者无进展生存预后的独立危险因素（P均＜0.05）。见表2、3。

表2 影响老年乳腺癌患者无进展生存预后的单因素Cox回归分析

表3 影响老年乳腺癌患者无进展生存预后的多因素Cox回归分析

3 讨论

近年来随着人口老龄化及人口预期寿命的延长，老年乳腺癌的发病也呈逐渐升高的趋势。据美国监测流行病学数据库统计，65 岁以上的乳腺癌患者占所有乳腺癌患者的40%［10］。目前早期老年乳腺癌主要采取改良根治术为主的综合治疗，但由于老年患者病史复杂、治疗耐受性等因素，部分患者术后会发生肿瘤复发、转移，导致治疗效果不佳。因此，深入研究乳腺癌发病机制，寻找能够评估老年乳腺癌预后的标志物，具有重要意义。

m6A修饰是真核细胞mRNA最常见的化学修饰方式。YTHDF1 是YTH 同源结构域蛋白家族成员，通过其羧基末端YTH 结构域与癌基因或抑癌基因的mRNA 结合，以m6A 修饰的方式调节基因mRNA的翻译，参与恶性肿瘤的发生、发展［5］。本研究中，乳腺癌组织中YTHDF1 蛋白表达上调，与既往研究［11］结果一致。乳腺癌中YTHDF1表达上调与基因扩增有关。研究发现，乳腺癌中YTHDF1 基因拷贝数存在扩增型突变，导致YTHDF1 在转录水平显著增加，YTHDF1抑制肿瘤微环境免疫细胞浸润，促进肿瘤免疫逃逸，导致肿瘤进展［12］。尚有研究发现，乳腺癌细胞中YTHDF1能够识别结合转录因子叉头框M1 的mRNA，促进其m6A 修饰及蛋白翻译，促进细胞周期由G0期向G1期转换和上皮-间充质转化的发生，导致肿瘤细胞过度增殖、迁移［11］。这与本研究观察到肿瘤最大径＞2 cm、合并淋巴结转移及TNM 分期Ⅱ期乳腺癌组织中YTHDF1蛋白阳性表达率高一致。本研究中，YTHDF1 蛋白阳性表达的老年乳腺癌患者无进展生存预后较差，提示YTHDF1 是潜在的评估老年乳腺癌患者预后的肿瘤标志物。YTHDF1 蛋白阳性表达的患者肿瘤恶性程度高，肿瘤远处转移能力强，术中残留肉眼难以分辨的转移灶，增加患者术后复发和转移的风险［13］。且有研究结果显示，YTHDF1 能够促进肿瘤细胞的DNA 复制和DNA 损伤修复，降低乳腺癌肿瘤细胞对阿霉素、顺铂及PARP抑制剂Olaparib治疗的敏感性，导致患者不良预后［14］。

E2F8 编码基因位于人类11 号染色体，属于转录因子家族成员，其能够调节细胞周期G1期到S 期的进展，维持正常细胞增殖。近年来发现，甲状腺癌［15］、多发性骨髓瘤［16］等恶性肿瘤中，E2F8 的过度表达能够促进启动子区含有E2F元件的癌基因如周期素D1、有丝分裂相关激酶2 等的表达，促进肿瘤无限增殖。本研究中，乳腺癌组织中E2F8蛋白表达上调，与肿瘤TNM 分期、最大径、淋巴结转移有关，提示E2F8促进老年乳腺癌的发生、发展。乳腺癌中E2F8表达升高与转录后调控异常有关。研究表明，乳腺癌肿瘤细胞中RNA 结合蛋白NONO 能够与E2F8 mRNA 前体结合，促进E2F8 mRNA 前体的剪接，增强E2F8的表达［17］。此外，肿瘤中E2F8表达上调能够激活核因子κB 信号通路，促进肿瘤细胞上皮-间充质转化，增强肿瘤细胞迁移和侵袭能力，导致肿瘤进展［18］。本研究中E2F8 蛋白阳性是影响老年乳腺癌患者无进展生存预后的独立危险因素，表明检测癌组织中E2F8的表达有助于评估患者预后。分析其原因，E2F8的表达升高能够激活肿瘤细胞中微管相关丝氨酸/苏氨酸激酶，促进ER+乳腺癌细胞的有丝分裂进程，抑制顺铂诱导的乳腺癌肿瘤细胞凋亡［19］。此外，有研究发现，胶质瘤中E2F8 的表达升高能够直接结合检查点激酶1 启动子区，激活检查点激酶1 的转录，增强肿瘤细胞具对放射治疗的抗性，导致患者不良预后［20］。本研究中，老年乳腺癌患者癌组织中YTHDF1与E2F8蛋白表达呈正相关，表明两者共同参与乳腺癌的发生、发展。研究表明，E2F8 是YTHDF1 的靶分子，YTHDF1 以甲基转移酶14 依赖的方式m6A 修饰E2F8 mRNA，增强E2F8 mRNA 稳定性，促进肿瘤细胞DNA 损伤修复，导致化疗耐药性的形成［14］。

综上所述，老年乳腺癌组织中YTHDF1、E2F8蛋白高表达，两者与肿瘤TNM 分期、肿瘤最大径及淋巴结转移有关，在乳腺癌肿瘤发生、发展中可能发挥协同作用。YTHDF1、E2F8 蛋白阳性是影响老年乳腺癌患者无进展生存预后的独立危险因素。本研究未能对YTHDF1、E2F8 在乳腺癌中的作用机制进行研究，有待进行深入的基础和临床试验，进一步探讨两者的临床应用价值。