子宫内膜异位症患者异位子宫内膜组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表达变化观察

吕丽丽，苌雨环，李曼，王梦格，裴子伟，叶国柳

蚌埠医学院第一附属医院妇产科，安徽蚌埠233004

子宫内膜异位症（EMs）是一种良性的慢性妇科疾病，为子宫内膜和子宫肌层外的子宫内膜组织异常生长，多发生于育龄期妇女，最常见的症状为痛经、盆腔疼痛和不孕症［1］。研究［2-4］表明，EMs发生与腹膜微环境诱导的慢性炎症过程有关；此外，种植在EMs 患者腹膜表面的异位子宫内膜细胞在腹腔液中生长发育，从而形成了一个特定的腹腔炎性微环境，导致EMs 异位病变及腹腔液中炎性细胞因子、血管生成因子、趋化因子等发生周期性改变，从而促进异位子宫内膜细胞植入以及局部新生血管形成［5］。因此，炎症反应是该病的主要病理生理过程。有证据［6］表明，NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体与EMs的发生发展密切相关。NLRP3炎症小体由传感器NLRP3、适配器ASC和效应器pro-cas⁃pase-1 组成，当被机体内源性和外源性刺激激活后，可将pro-caspase-1 活化为成熟形式的Caspase-1，进而发挥剪切功能使得细胞分泌大量炎症因子，包括IL-1β以及IL-18［7］，使机体发生一系列炎症反应。然而目前关于NLRP3、Caspase-1、IL-1β 以及IL-18 在EMs异位内膜组织及腹腔液中的表达情况尚不清楚。本研究观察了NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 在EMs 组织中的表达变化，并进一步分析NLRP3、Cas⁃pase-1 与EMs 患者临床病理特征的关系，以探讨炎症与EMs发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入2022 年1 月—2023 年3 月就诊于蚌埠医学院第一附属医院妇科行卵巢囊肿剔除术的EMs 患者80 例（EMs 组），同期因患子宫肌瘤而行全子宫切除术患者80例 （非EMs组）。纳入标准：符合中华医学会制定的EMs诊治指南中的诊断标准；所有患者手术前3个月未接受激素治疗；无严重全身性疾病。排除标准：合并良性肿瘤息肉、增生、癌症；临床病理资料不完整。EMS 组年龄22～53（35.22 ±7.813）岁，体质量40～93（59.52 ± 8.528）kg；非EMS组年龄28～53（44.07 ± 6.340）岁，体质量46～86（62.84 ± 8.575）kg。两组年龄、体质量比较无统计学意义（P均＞0.05），具有可比性。本研究经蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会批准（2023YJS094），患者均签署知情同意书。

1.2 两组子宫内膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 检测 采用免疫组织化学染色法（IHC）。EMs 患者术中留取异位子宫内膜组织，非EMs 患者术中留取正常子宫内膜组织。组织标本经生理盐水冲洗后，用4%甲醛溶液固定24 h，经洗涤、脱水、脱蜡、包埋，石蜡凝固后备用。首先在柠檬酸钠缓冲液中进行抗原修复20 min；再用过氧化氢溶液孵育15 min 后PBS 洗涤5 次；最后加入封闭液继续孵育10 min 进而阻断非特异性结合。加入NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 抗体（1∶200），4 ℃孵育过夜。次日，洗涤5 次后和二抗孵育结合，于室温下反应1 h 后再次洗涤5 次，经DAB 显色，苏木素复染，常规脱水封片，显微镜下观察。在低倍镜下随机选取5 个视野，按照染色强度和细胞阳性率进行评分。染色强度评分：0 分为细胞不着色，1 分为细胞淡黄色，2 分为细胞棕黄色，3 分为细胞深棕色或棕红色；细胞阳性率评分：1 分为细胞染色1%～25%，2 分为细胞染色26%～50%，3 分为细胞染色51%～75%，4 分为细胞染色大于75%。将染色强度得分与细胞阳性率得分相乘，≤3 为表达阴性，＞3为表达阳性。

1.3 两组腹腔冲洗液中IL-1β、IL-18 检测 采用酶联免疫吸附法。在腹腔镜手术中收集经10 mL 氯化钠溶液冲洗的卵巢、子宫处的冲洗液，回收率＞85%，在离心机中经1 000 r/min 离心 20 min 后留取上清，置于－80 ℃下保存待测。在收集过程中，腹腔冲洗液被血液污染的患者不纳入研究。共收取30 例EMs 患者以及30 例非EMs 患者腹腔冲洗液。根据IL-1β 和 IL-18 ELISA 试剂盒（购自江苏晶美生物科技有限公司）说明书操作，最后在450 nm处读取光密度（OD）值并记录。使用EXCEL绘制关于OD值—标准品浓度的标准曲线，根据得到的标准曲线方程式计算IL-1β和IL-18水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以±s表示，比较采用独立样本t检验；计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组子宫内膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表达阳性率比较 EMs组异位子宫内膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18呈阳性表达，组织IHC染色图见图1。EMs 组异位子宫内膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表达阳性者分别为46（57.50%）、52（65.00%）、59（73.75%）、55例（68.75%），非EMs组正常子宫内膜组织中分别为32（40.00%）、36（45.00%）、44（55.00%）、42例（52.50%）。两组比较，χ2值分别为4.903、6.465、6.132、4.425，P均＜0.05。

图1 EMs组和非EMs组中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的表达（IHC染色，×100）

2.2 两组腹腔冲洗液中IL-1β、IL-18水平比较 EMs组腹腔冲洗液中IL-1β、IL-18 水平分别为（78.27 ±11.51）、（94.25 ± 14.87）pg/mL，非EMs组IL-1β、IL-18水平分别为（62.59 ± 9.64）、（70.99 ± 11.72）pg/mL，EMs 组腹腔冲洗液中IL-1β、IL-18 水平高于非EMs组（t值分别为2.728、3.089，P均＜0.01）。

2.3 不同临床病理分期的EMs 患者异位子宫内膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表达阳性率比较 不同临床病理特征的EMs 患者异位子宫内膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 表达阳性例数见表1。不同临床分期及是否存在痛经的EMs患者异位子宫内膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表达阳性率比较，P均＜0.05。

表1 不同临床病理特征的EMs患者异位子宫内膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表达阳性例数（例）

3 讨论

EMs 是育龄期女性常见的慢性妇科疾病，又被称为“不死癌症”，严重的疼痛和不孕症对她们的精神心理和个人生活质量造成了严重威胁。目前手术剔除和激素治疗是主要的治疗方案，但手术治疗复发率较高，而激素治疗往往伴随严重的并发症，如卵巢功能降低、更年期症状和骨密度下降，同时在激素治疗期间，患者不能受孕［8］。研究［9］发现，EMs 异位病变诱发的炎症不仅是疾病进展的关键因素，也是患者手术和激素治疗后复发的根本原因。因此有必要探讨炎症在EMs 发生发展中作用，为EMs 的治疗提供新的干预途径。

有研究［10］发现，NLRP3 和IL-1β 是有潜力的抗炎治疗靶点。NLRP3 炎症小体作为一种模式识别受体存在于细胞质中，可识别病原体或损伤相关分子模式并招募和激活促炎蛋白酶Caspase-1，激活的Caspase-1 可活化IL-1β、IL-18 前体，在炎症和应激条件下诱导细胞死亡［11］，从而在EMs 中起到致炎作用。IL-1β主要由巨噬细胞产生，可以使炎症产生级联反应［12］。HANG 等［6］研究发现，在EMs 病灶培养的异位子宫内膜细胞中，NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18 表达均升高，且伴随细胞上清液中IL-1β、IL-18 水平的升高。HAN 等［13］发现，在EMs 小鼠异位病灶中，NLRP3 表达被抑制的异位病灶体积显著缩小，激活的Caspase-1 可以活化NLRP3 来增强IL-1β 表达，进而使得EMs 异位组织的黏附性增强。ZHOU 等［14］研究发现，NLRP3 的激活可以通过分泌IL-1β 来推动EMs 微环境中异位子宫内膜基质细胞的迁移。这些研究结果提示NLRP3 炎症小体在EMs的发病中起重要作用。

本研究发现，在EMs 异位子宫内膜组织中，NLRP3 及其下游的Caspase-1、IL-1β 及IL-18 高表达，进一步提示NLRP3 炎症体可能与EMs的进展密切相关。随后我们分析了NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18与EMs临床病理特征的关系，发现其与患者的临床分期及痛经有关，且Ⅲ～Ⅳ期炎症因子水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期，因此推测NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18与EMs疼痛及病情严重程度有密切关系。同时，我们发现在EMs 患者腹腔冲洗液中促炎细胞因子IL-1β 和 IL-18 表达较高，这一现象提示我们EMs 患者盆腔处于一个炎症微环境中，升高的IL-1β和 IL-18可以进一步激活巨噬细胞等炎症细胞释放NLRP3 炎症小体激活Caspase-1 诱导 IL-1β 及IL-18释放，形成局部炎症，从而促进EMs的发生。

综上所述，EMs 患者异位子宫内膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 高表达，NLRP3、Caspase-1表达水平与患者病情有关。