Toll样受体4激动剂LPS腹腔注射对大鼠心肌缺血再灌注损伤的预防作用及其作用机制

班努·库肯，严金龙，王敏敏，赵海燕，徐长生，徐霞，杨梦智

1 新疆医科大学第七附属医院心内科，乌鲁木齐 830001；2 新疆医科大学第七附属医院医务部

冠心病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄、阻塞，造成心肌缺血缺氧或坏死导致的心脏病，是导致患者死亡的常见原因之一［1］。通过抗溶栓药物或机械干预适当或及时地恢复血流是心肌缺血的主要治疗方法［2］。然而，通过干预去除阻塞使血流恢复通畅过程中，可能会诱发先前缺血部分心肌出现继发性损伤，称为心肌缺血再灌注损伤（MIRI）［3］。多种机制如炎症、细胞凋亡、细胞自噬、内质网应激、新陈代谢改变等［4-5］参与MIRI，目前尚无特效治疗方法。Toll 样受体（TLR）是参与先天免疫的一类蛋白质分子，存在于人体各种免疫细胞中，能够识别并结合相应病原物，从而诱导先天免疫反应和炎症反应。TLR4作为TLR家族成员之一，能够结合革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖（LPS），从而活化炎性细胞并释放炎性因子，介导炎症反应［6］。在特定情况下，TLR4能够发挥心肌保护作用。有研究［7］发现，使用TLR4 受体激动剂LPS 小剂量预处理能够促进MIRI 后心脏功能恢复，减少心肌梗死面积，但作用机制尚不明确。转录因子叉头框蛋白O3a（FoxO3a）是一种高度进化保守的转录因子，介导许多细胞过程，包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞代谢等。SAMUEL 等［8］研究结果显示，红景天苷能够抑制FoxO3a 的活化，从而减少心肌梗死面积，减轻心肌细胞凋亡，改善心脏功能，证实FoxO3a的活化与心肌梗死细胞持续凋亡相关。在组织细胞处于缺血缺氧的应激状态时，FoxO3a 能够调控细胞自噬而发挥重要作用［9］。FoxO3a 通常位于细胞质中，经磷酸化等修饰后，能够从细胞质定位到细胞核，作为信号途径参与细胞自噬的过程［10］。因此我们猜测，FoxO3a 可能在LPS 预处理抑制炎症反应、调节细胞自噬从而减轻IRI 中发挥重要作用。2021年6月—2022年3月，我们观察了LPS腹腔注射后进行缺血再灌注处理的大鼠心功能、组织病理、心肌梗死面积，心肌组织FoxO3a 通路蛋白、自噬相关蛋白（Beclin-1、LC）的变化，以明确LPS 对于大鼠MIRI 是否有预防作用以及其作用机制，以期为临床上MIRI治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂、仪器 60 只雄性SD 大鼠，8～10 周龄，体质量200～250 g，昼夜节律，自由进食、饮水，购自杭州医学院动物实验中心（生产许可证号码：SCXK（浙）2019-0002）。实验于杭州医学院实验动物中心SPF 级动物实验室进行（SYXK（浙）2019-0011），室温（22 ± 2）℃，相对湿度60%～80%。主要试剂：盐酸维拉帕米注射液（上海禾丰制药有限公司）；LPS（sigma）；TTC染色液（索莱宝）；兔抗FoxO3a多克隆抗体、兔抗FoxO3a（phospho-ser253）多克隆抗体、兔抗Beclin 多克隆抗体、兔抗LC3B 多克隆抗体（博奥森公司）；鼠抗β-actin 单克隆抗体（义翘神州）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 抗体（英国Abcam公司）；HE染色试剂（索莱宝公司）；BCA蛋白浓度定量试剂盒（全式金厂）；RIPA 裂解液（武汉博士德生物工程公司）；SDS-PAGE 凝胶（Sangon Bio⁃tech公司）；PVDF膜（Millipore）；水合氯醛（上海源叶生物科技公司）。仪器：电子天平（上海菁海仪器有限公司，型号DY15K）；精密电子天平（上海菁海仪器有限公司，型号FA2004N）；台式低速离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司，型号SF-TDL-5C）；恒温水浴锅（恒温水浴锅，型号DK-80）；小动物人工呼吸机（北京众实迪创科技发展有限责任公司，型号ZS-MV-HXB）；MadLab 生物信息化医学信号采集处理系统（北京众实迪创科技发展有限责任公司）；液氮罐（成都金凤仪器厂）；-20 ℃低温冰箱（合肥美菱公司）；-80 ℃低温冰箱（合肥美菱公司）。

1.2 大鼠分组、LPS 腹腔注射、缺血再灌注处理将60 只大鼠根据随机数字表法分为LPS 干预组（0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg）、维拉帕米干预组、模型组、假手术组，每组15 只。构建MIRI 模型前7 d，LPS 干预组于给予不同的小剂量LPS（0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg）腹腔注射，维拉帕米干预组给予2.5%维拉帕米（2 mg/kg）腹腔注射，假手术组与模型组给予等容量生理盐水腹腔注射；均每日1次。然后，除假手术组外，其余组大鼠进行缺血再灌注处理。

缺血再灌注处理步骤：大鼠缺血再灌注前禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后固定于解剖台，四肢连接心电图机，然后解剖暴露心脏，采用结扎冠状动脉左前降支［9］的方法进行缺血再灌注处理。用7-0丝线结扎冠状动脉30 min致心肌缺血变白，心电图可见ST段升高；接着松解结扎部位，恢复血流，心电图显示ST段回落，心肌由白变红，随后关闭胸腔。

1.3 大鼠心功能指标检测 大鼠经过上述处理后72 h，经腹腔注射10%水合氯醛麻醉，采用IE33 彩色多普勒超声诊断仪观察各组大鼠各腔室大小及室壁运动情况。心脏功能测定软件计算大鼠左心室收缩末壁厚度（LVPWs）、左心室舒张末壁厚度（LVPWd）、左心室收缩末内径（LVIDs）、左心室舒张末内径（LVIDd）、左心室收缩末容积（LVESV）、左心室舒张末容积（LVEDV）、左心室射血分数（LVEF）、短轴缩短率（LVFS），连续测量3 个心动周期后计算平均值。

1.4 大鼠心肌组织病理学变化观察、梗死面积测算 心肌组织病理学变化观察：采用HE 染色法。按试剂盒步骤操作后，于光学显微镜下观察各组大鼠心肌组织病理变化并采集图像。

心肌梗死面积测算：采用TTC 染色法。各组大鼠心脏组织置于－80 ℃冰箱冷冻后，将组织沿横断面切成4～5片，用1% TTC避光复染15 min，4%多聚甲醛溶液固定后拍照。红色区域为心肌非梗死区，白色区域为心肌梗死区域，AlphaEaseFC处理软件分析各组大鼠心肌梗死面积及心肌总面积，计算心肌梗死面积面积百分比（心肌梗死面积/心肌总面积）。

1.5 大鼠心肌组织中FoxO3a、pFoxO3aS253、Beclin-1、LC3 的检测 采用Western blotting 法。将冻存的心肌组织剪碎，移入预先加好RIPA裂解液的离心管中，超声波破碎研磨，冰上裂解30 min 以提取总蛋白，BCA 法定量，然后按试剂盒说明书操作，凝胶成像显影仪成像并获得蛋白条带，以β-actin 蛋白作内参，Image-Pro Plus 软件分析条带灰度值，目的蛋白与β-actin 蛋白的灰度值之比表示目的蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0 软件进行统计分析。计量资料以±s表示，比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能指标比较 各组大鼠心功能相关指标检测结果见表1。与假手术组比较，模型组大鼠LVEF、LVFS 减小（F分别为6.410、5.921，P均＜0.05）；与模型组比较，维拉帕米干预组和LPS干预组大鼠LVEF、LVFS 增加（F分别为6.410、5.921，P均＜0.05）。

表1 各组大鼠心功能相关指标检测结果（± s）

表1 各组大鼠心功能相关指标检测结果（± s）

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2.2 各组大鼠心肌组织病理学变化、心肌梗死面积比较 假手术组大鼠心肌纤维排列整齐，心肌细胞形态规则，可见横纹，未见明显异常；模型组大鼠心肌纤维排列紊乱，断裂严重，可见较多出血灶，心肌细胞水肿严重，部分溶解、坏死或核固缩，间质可见较多炎性细胞散在或灶状浸润；与模型组比较，0.1 mg/kg LPS干预组及0.5 mg/kg LPS干预组大鼠心肌病变改善不明显，维拉帕米干预组及1 mg/kg LPS干预组大鼠心肌纤维断裂、心肌细胞坏死及炎细胞浸润程度均明显减轻。

0.1 mg/kg LPS 干预组、0.5 mg/kg LPS 干预组、1 mg/kg LPS干预组、维拉帕米干预组、模型组、假手术组心肌梗死面积百分比分别为26.60% ± 0.98%、23.04% ± 1.48%、12.87% ± 4.45%、12.51% ±1.23%、35.02% ± 2.81%、0.00% ± 0.00%。 与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死面积百分比升高（F=85.432，P＜0.05）；与模型组比较，维拉帕米干预组及LPS干预组的大鼠心肌梗死面积百分比均降低（F=85.432，P＜0.05）。

2.3 各组大鼠心肌组织FoxO3a、pFoxO3aS253、Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白相对表达量比较 各组大鼠心肌组织FoxO3a、pFoxO3aS253、Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白相对表达量见表2。与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中FoxO3a 蛋白相对表达量未发生变化（F为6.410，P＞0.05）；与模型组比较，维拉帕米干预组及LPS 干预组的大鼠心肌组织中FoxO3a蛋白相对表达量也均未发生变化（F为6.410，P＞0.05）。与假手术组比较，模型组pFoxO3aS253蛋白相对表达量下调（F为11.521，P＜0.05）；与模型组比较，维拉帕米干预组及LPS 干预组大鼠心肌组织中pFoxO3aS253蛋白相对表达量均上调（F为11.521，P＜0.05）。与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白相对表达量升高（F为69.473、20.468，P＜0.05）；与模型组比较，维拉帕米干预组及LPS 干预组的大鼠心肌组织中Beclin1、LC3 Ⅰ/Ⅱ蛋白相对表达量下降（F为69.473、20.468，P均＜0.05）。

表2 各组大鼠心肌组织FoxO3a、pFoxO3aS253、Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白相对表达量（± s）

表2 各组大鼠心肌组织FoxO3a、pFoxO3aS253、Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白相对表达量（± s）

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3 讨论

TLR4是外源性病原体的受体，通过免疫细胞启动炎症，并调节MIRI中的细胞凋亡与自噬相关发病机制。已有研究［11］指出，MIRI 早期炎症细胞因子的产生取决于TLR4 表达水平，TLR4 及其介导的信号转导通路的激活和炎性反应的发生在MIRI 中起了重要作用。因此，抑制MIRI 诱导的TLR4 表达并阻断TLR4 介导的心肌炎症、细胞凋亡和自噬可以改善心肌损伤，从而减少MIRI 诱导的心肌梗死。LPS是革兰阴性菌细胞壁中的一种特有成分，LPS 本来是促进炎症反应的因素，然而，越来越多的研究表明，小剂量TLR4 受体激动剂LPS 预处理后，LPS 结合蛋白（LBP）能够将LPS 转移至CD14，CD14 将LPS聚集体分解成单体分子并呈递给TLR4-MD-2 复合物，结合LPS 后的TLR4-MD-2 复合物导致多种信号成分的激活，包括宿主先天免疫反应，而当再次受到LPS 刺激时，炎症反应则会被抑制，这一现象被称为内毒素耐受［12］，这也是小剂量LPS 预处理减轻MIRI的重要作用机理。

据报道，大剂量 LPS 处理可造成脓毒血症，对各器官造成一定损伤，而小剂量 LPS 预处理能对MIRI 产生一定的保护作用［13］，其机制中涉及到炎症反应。研究表明，对心肌IRI 给予不同剂量的LPS（0.1～1 mg／kg）预处理可以改善心肌功能，减小心肌梗死面积，从而能对IRI 心肌产生保护作用［14-15］。卿羽等［13］研究表明，连续7 d 腹腔注射1.5 mg/（kg·d）LPS 对小鼠进行预处理后再诱导MIRI 模型，能够明显减小心肌梗死面积，与其升高心肌组织蛋白质糖基化修饰水平有关。CHU等［14］通过使用LPS预处理的骨髓来源间充质干细胞（MSCs）与未经处理的骨髓来源MSCs 治疗MIRI 小鼠后发现，LPS 预处理的MSCs比未经处理的MSCs具有更好的心功能恢复效果，对小鼠的心脏保护作用更佳。

本研究拟参考上述剂量，建立大鼠IRI 模型，探讨小剂量LPS预处理对IRI的作用及其机制，故本研究选择3 个剂量（0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg）的LPS 对大鼠每日进行腹腔注射。因维拉帕米可以阻断钙离子内流，防止线粒体内钙离子超载，减轻缺血再灌注损伤，故设为阳性对照组。连续注射7 d以诱导持续性炎症反应后再建立MIRI模型，通过检测心功能相关指标发现，0.1 mg/kg LPS预处理能够使大鼠LVPWs 增加，0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg LPS预处理能够使大鼠LVIDs、LVESV 减小，LVEF、LVFS 增加，从而改善MIRI 诱导的心功能障碍。此外，经过对心肌组织进行形态病理学与心肌梗死面积检测发现，1 mg/kg LPS预处理后缺血再灌注大鼠心肌纤维水肿、断裂、坏死及炎细胞浸润程度均明显减轻，0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg LPS 预处理后缺血再灌注大鼠心肌梗死面积百分比降低，与文献报道结果一致，提示小剂量LPS 预处理能够改善大鼠MIRI症状，发挥心肌保护作用。较其他两个小剂量组，1 mg/kg LPS 预处理后缺血再灌注大鼠心肌纤维水肿、断裂、坏死及炎细胞浸润程度均明显减轻。

FoxO3a 参与诱导关键细胞过程的靶基因表达，包括氧化应激、葡萄糖代谢、炎症反应和细胞凋亡等，并已知分子可以在翻译后调节FoxO3a的转录活性。研究表明，FoxO3a 可能在缺血再灌注诱导的组织损伤中起着重要作用，例如，轻度低温预处理可增加MIRI 后的蛋白激酶B（AKT）和FoxO3a 的磷酸化水平，并减少细胞凋亡和炎性细胞因子释放，对肝脏起到保护作用［15］；间充质干细胞衍生外泌体通过增加FoxO3a表达以增强线粒体自噬，从而保护小胶质细胞免受缺血再灌注诱导的焦亡并减轻神经元损伤；缺血再灌注诱导的肝组织中FoxO3a 磷酸化水平降低，川陈皮素通过激活沉默调节蛋白1（SIRT-1）/FoxO3a介导的自噬和线粒体功能从而改善肝缺血再灌注损伤。关于FoxO3a 在MIRI 中的作用也已有报道［7］。本研究结果同样显示，0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg LPS 预处理能够上调MIRI 大鼠心肌组织内pFoxO3aS253蛋白相对表达量，表明FoxO3a 在S253 位点磷酸化，推测这可能是LPS 预处理对MIRI 大鼠发挥保护作用的机制。本研究还发现，相较于直接构建MIR 模型大鼠， LPS 预处理后缺血再灌注大鼠心肌组织中LC3B 蛋白相对表达量降低，自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1 相对表达量下调，由此推测，小剂量LPS 预处理能够抑制MIR 诱导的心肌细胞凋亡，该作用可能与抑制自噬水平有关。本研究3 个小剂量LPS 预处理组中1.0 mg/kg 组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1相对表达量下调更明显，结合前述病理结果，在今后研究中选择1.0 mg/kg LPS预处理可更好减轻大鼠MIRI。

综上，小剂量TLR4受体激动剂LPS预处理能够减轻大鼠MIRI，对大鼠心脏起保护作用，该机制可能与激活FoxO3a 磷酸化及抑制Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白活化有关，这可能是小剂量LPS 预处理减轻大鼠MIRI 的机制之一。但LPS 因其毒性不可直接用于缺血再灌注诱导的器官损伤临床治疗中，且TLR4可能通过多条信号通路在MIRI中起作用，充分研究相关调控机制才能更好地为MIRI治疗提供思路。