毛白杨组培快繁研究

王 南

(宝鸡市陈仓区林业工作站,陕西 宝鸡 721399)

0 引言

毛白杨(PopulustomentosaCarr.),乔木,高30 cm,树冠宽卵形。是黄河流域防护林建设、速生丰产林建设、平原绿化、胶合板工业、造纸工业、木材工业等森工领域的好品种。花期3月,果实成熟期为4月上旬～5月中旬[1]。

毛白杨有性生殖能力普遍较低[2],因为毛白杨为雌雄异株,雌株数量较雄株少,而且雌雄株花期不遇,雌性毛白杨花芽小而稀,比雄性毛白杨开花迟15～20 d[3]。不容易结实,生产上一般不进行有性繁殖,大多使用无性繁殖。经常采用根繁、嫁接和扦插等繁殖方法进行育苗。比如崔振荣所著的毛白杨的无性繁殖措施中的伐根嫁接、枝接来扦插育苗[4]。这种育苗方式由于受材料、季节等因素的限制,繁殖速度慢并且容易遭受病毒的危害,而组织培养技术不受气候和季节的限制,便于稳定地进行周年生产,苗木繁殖速度快,效率高,繁殖材料来源广泛,可有效脱出植物所带的病毒等优点。植物组织培养技术的应用范围很广,目前主要用在离体无性系快速繁殖与无毒化、植物育种、遗传物质的保存、植物次生代谢物的生产和植物基因转化等方面[5]。

在实际应用中根据不同的植物或不同植物的不同部位选择不同的培养基[6]。植物生长调节剂的研究及其在生产上的应用是近代植物学及农业科学的重大进展之一[7]。植物生长调节剂在促进扦插生根、提高嫁接成活率、提高组织培养效果等方面发挥着重要的作用[8]。植物生长调节剂NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸),IBA(吲哚丁酸)作为重要的内源激素,参与了植物生长和发育的诸多过程,如根和茎的生长、器官的衰老、维管束组织的形成和分化发育以及植物的向地和向光反应等[9]。要根据不同的植物对象及其部位和不同的目的选择合适的药剂。

毛白杨组织培养体系的资料较多,利用芽变毛白杨叶片作为外植体进行不定芽诱导的最佳培养基是MS+1.0 mg/L6-BA+0.1 mg/LIBA+0.1 mg/LGA[10]。利用三倍体毛白杨的休眠芽作为外植体,三倍体毛白杨快繁的适宜增值培养基为1/2MS+0.4 mg/LNAA+0.5 mg/LNAA,适宜壮苗、生根的培养基为1/2MS+0.5 mg/LNAA[11]。利用三倍体毛白杨茎段作为外植体,三倍体毛白杨在MS+0.5 mg/LBA+0.25 mg/LIBA+0.2 mg/LNAA上每周3能增值5.6～7.8倍,在1/2MS+1.0 mg/LIAA的培养基上生根率为72.8%～76%[12]。

毛白杨组织培养的资料虽然比较多,但是人们工作的注意力仍更多地集中在对不同浓度的单一生长素类或不同浓度及比例的生长素类和细胞分裂素类对根的诱导效率的影响。以毛白杨休眠枝作为实验材料,在H培养基上附加不同浓度IBA、IAA对茎段生芽的影响进行研究,以及在1/2MS培养基上,探讨了6-BA、NAA不同浓度组合对丛生芽增殖的影响,IAA、IBA和NAA不同浓度组合对生根的影响,筛选出有利于毛白杨丛生芽增殖培养和生根培养的生长组合,旨在为毛白杨快繁体系优化提供资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以毛白杨一年生休眠枝条为试验材料。

1.2 实验方法

1.2.1 外植体的获取。对一年生休眠枝条进行水培,待水培芽长到3～5 cm后,剪取一段3 cm左右的带芽茎段,每段保留2个侧芽,用洗衣粉漂洗后,10%的84消毒液消毒8～12 min,蒸馏水清洗,用滤纸吸干水分,然后在超净工作台上置75%酒精浸泡1～2 s,用无菌水清洗3次,迅速倒入1 g/L的升汞液中,浸泡8 min,用无菌水清洗4次,最后用无菌水浸泡备用。接种时将茎段放在消毒好的滤纸上,接种到不同激素配比的H培养基中诱导分化。

1.2.2 诱导分化培养。选用H为基本培养基,附加不同浓度的IBA和IAA,IBA和IAA的浓度设置都为4个梯度,分别为0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L。共组成16种不同激素浓度配比的培养基。将3 cm左右的带芽茎段接种到含有不同激素配比的H培养基中(表1),蔗糖浓度2%,琼脂浓度为0.4%。每瓶接种3～4块外植体,每一个梯度接10瓶。

表1 不同激素配比的H培养基

培养条件:培养室温度(20±5)℃,光照14 h,光强1500～2000 lx,pH5.8。

1.2.3 芽的增殖培养基。选用1/2 MS为基本培养基,附加不同浓度的6-BA、NAA,将在诱导培养基上长出的丛生芽切割成较小的丛芽块或待外植体腋芽萌动抽枝后再进行分割切段,接种在增殖培养基上进行增殖。每瓶接种3～4块外植体,每一个梯度接10瓶。接种在以下培养基上,1/2MS+1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA、1/2MS+1.0 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA、1/2MS+0.5 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA。

培养条件:培养室温度(20±5)℃,光照14 h,光强1500～2000 lx,pH5.8。

1.2.4 诱导生根培养。选用1/2MS为基本培养基,附加不同浓度的IAA、IBA和NAA,IAA和IBA的浓度设置3个梯度,分别为:0、0.2、0.5 mg/L;NAA浓度设置3个梯度,分别为:0、0.1、0.2 mg/L。每瓶接种3～4块外植体,每一个梯度接10瓶。设置采用单芽茎段法,即将分化阶段带芽嫩枝切成小段(每个茎段带一个腋芽)直接接种在生根培养基(表2)上诱导生根。

表2 不同激素配比1/2MS培养基

培养条件:培养室温度(20±5)℃,光照14 h,光强1500～2000 lx,pH5.8。

2 结果与分析

2.1 芽诱导分化的培养

为了探讨不同浓度比例的生长素对芽诱导分化的影响,以H作为基本培养基,IAA、IBA均分别采用0.5、1.0、1.5和2.0 mg/L的浓度梯度;对接种在芽诱导培养基上的单芽茎段或顶芽经15 d培养后其分化情况如表3所示。

表3 毛白杨外植体生长分化情况试验方案和成果分析表

由表3得出,在含有1.5 mg/LIBA、1.5 mg/LIAA的培养基中,外植体经过两周后,开始发芽、展叶,且生长好,诱导分化率为84.2%;在含有0.5 mg/LIBA、1.5 mg/LIAA和0.5 mg/LIBA、0.5 mg/LIAA的培养基中,外植体经过两周后,开始发芽、展叶,但生长一般,诱导分化率低且仅为40%。在IAA的四个浓度梯度中,分化出最多芽个数的IAA浓度为1.5 mg/L;在IBA的四个浓度梯度中,分化出最多芽个数的IBA浓度也为1.5 mg/L。在实验中,以H为基础培养基附加4个浓度梯度的培养基中最佳的组合为H+1.5 mg/LIAA+1.5 mg/LIBA。

2.2 芽的增殖培养

以1/2MS作为基本培养基,分别添加两种不同浓度的6-BA与三种浓度不同的NAA组合,将从外植体获得的芽切成茎段分别接入以下所示培养基中,观察芽的生长情况,结果如表4所示。

表4 毛白杨丛芽增殖

由表4实验结果表明:毛白杨对6-BA和NAA的浓度范围适应性较广,在三种培养上均可形成丛生芽,有的茎段上长着不止一个芽,但以较低浓度的6-BA和NAA配合使用效果为佳。接种在1.0 mg/L6-BA、0.5 mg/LNAA培养基的茎尖(段)虽诱导率高,达到100%,但其芽长势缓慢。而接种在1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA培养基的茎尖(段)虽芽长势快但诱导率很低。在实验中,1/2MS+0.5 mg/L6-BA+0.05 mg/LNAA为最适合丛芽增值的培养基,培养基的茎尖(段)芽长势快诱导率高。

2.3 芽的诱导生根培养

以1/2MS作为基本培养基,分别附加不同浓度的IAA、IBA、NAA进行组合,将增殖培养基上大于3 cm的芽剪下接种在生根培养基上,培养15 d后,基部膨大,并逐步形成发达的根系,如表5所示。

表5 毛白杨生根情况和成果分析表

由表5得知,在0、0.5 mg/L IAA浓度下,毛白杨生根最好;在0.2 mg/L IBA浓度下,毛白杨生根最好;在0 mg/LNAA下,毛白杨生根最好。由以上分析得出,理论上得出适合毛白杨生根的培养基有1/2MS+0.2 mg/LIBA,1/2MS+0.5 mg/LIAA+0.1 mg/LIBA。由表5可知,在1/2MS+0.2 mg/LIBA培养基下,生根率达到90%,达到最高生根率。

3 讨论

3.1 激素配比与芽的诱导

杨树组织培养研究表明,植物生长调节剂中的细胞分裂素与生长素是诱导外植体脱分化的主要因素,其种类和浓度的配比对芽的诱导关系重大[13]。试验进行的IAA与IBA 配比研究表明,1.5 mg/LIAA与1.5 mg/LIBA配比对毛白杨芽诱导率最高,可达84.2%。与董晨波等[14]茎段培养的培养基为MS +0. 25 mg/LBA+ 0. 05 mg/LNAA+0. 25 mg/LIAA相比,人们工作的注意力更多地集中在对不同浓度的单一生长素类以及不同浓度的IAA与BA不同浓度之间的配比对茎段诱导分化的影响。而文章研究了在IAA和IBA配合使用的生长素对分化诱导的影响。

3.2 激素配比与芽的增殖

6-BA是启动细胞分化的主要激素, 主要作用是促进芽的形成,也可以诱导愈伤组织发生[15]。当BA 与NAA的浓度比例低时,有利于愈伤组织的形成和芽的生长,比例高时有利于芽的分化[11]。在本试验中则是以较低浓度的0.5 mg/L 6-BA和低浓度的0.05 mg/L NAA培养基对不定芽的分化诱导最佳,这可能与选取的基本培养基不同,从而对结果产生影响。

3.3 激素配比与芽的诱导生根

植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导和分化过程具有重要作用[16]。试验发现比较理想的毛白杨生根培养基为1/2MS+0.2 mg/LIBA、1/2MS+0.5 mg/LIAA+0.1 mg/LIBA。但是后期实验数据处理的时候才发现在实验过程中未设计在1/2MS+0.5 mg/LIAA+0.1 mg/LIBA培养基下毛白杨生根培养,需要进一步设计该培养基进行验证。然而IAA的成本要高于IBA的成本,所以在实验中1/2MS+0.2 mg/LIBA就是毛白杨生根最优的培养基。实验中以多种生长素不同浓度配比进行研究,浓度比例设置较多,并没有把所有的浓度进行正交设计。从实验所得数据分析得出理论值,将实验值与理论值进行比较分析得出最优的培养基。