基于ISSR标记的航天香蕉新材料的遗传特异性

王金英 李华盛 鹿金颖 蔡长福 蔡邦平

关键词：航天育种；香蕉；ISSR；遗传特异性

根据APGⅢ分类系统，香蕉（MusananaLour.）是单子叶植物分支下的姜目（Zingiberales）植物，属于芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa）。香蕉主要产于热带及亚热带地区，是世界上非常重要的一种热带水果和粮食作物，也是我国南部地区的重要经济作物之一。福建省香蕉栽培历史悠久，但是福建地处我国香蕉栽培适区的北缘，具有一定的局限性[1]。现今福建的香蕉产业受到病害、寒害或风害的严重威胁，以及外来或进口香蕉的冲击，正面临着规模萎缩的处境。因此，选育抗病、耐寒、优质、高产的香蕉新品种，已成为福建香蕉研究亟需解决的重要课题。

航天育种是利用太空环境中的极端条件（微重力、强辐射、高真空等因素），诱发植物的遗传物质发生改变，从中选择优良变异，培育优质、高产、多抗的植物新品种的育种方法[2]。将传统的育种技术与航天诱变技术相结合实现育种目标的方法，已经得到国内外育种专家的广泛认可。我国自1987年首次开展返回式卫星航天搭载水稻等农作物种子，距今已有30多年[3]。随着我国航天事业的发展，通过航天育种方式已选育出一大批优质、高产、多抗的新品种，正服务并助推着相关产业的发展。航天育种为植物新品种的选育打开了新世界的大门，也为香蕉新品种的选育开拓了新的途径。

简单重复序列区间（inter-simplesequencerepeat，ISSR）是由ZIEDEWIEZ等[4]提出的、基于SSR的基础上发展起来的一种DNA扩增多态性检测技术。因其具有DNA模板用量少、引物设计简单、操作快速高效、多态性好、稳定性好、可重复性高等优势，常在植物遗传多样性、种质资源鉴定、分类及亲缘关系分析等方面有广泛的应用[5-8]。本研究以2份航天香蕉种质和18份其他香蕉种质为材料，通过ISSR标记技术，旨在构建航天香蕉新材料的分子指纹图谱，以期为航天香蕉新品种的鉴定和分类提供参考。

1材料与方法

1.1材料

供试香蕉种质共20份，包括3个基因型（AAA、ABB、AA），其中18份来自厦门市园林植物园热带作物品种资源库香蕉种质圃，2份航天诱变香蕉材料（即航蕉1号和航蕉2号）由航天神舟生物科技集团有限公司提供（表1）。2份航天诱变香蕉材料是以巴西蕉为亲本，通过航天诱变、筛选而得。

以新鲜卷筒嫩叶作为提取香蕉DNA的材料。采集叶片组织时，按不同品种分别做好标识，迅速清洗擦净，并尽快用液氮速冻处理，再转至–80℃超低温冰箱保存，备用。

1.2方法

1.2.1DNA的提取采用CTAB法提取DNA，主要步骤如下：（1）在液氮中将叶片组织迅速研磨至粉末状，再迅速转入2mL离心管中；加入1mL3%CTAB裂解液和20μLβ-巯基乙醇，摇匀，65℃水浴20～30min；（2）10000r/min离心10min，取上清液，加入500μL氯仿∶异戊醇（24∶1）溶液，混匀；（3）重复上一步骤；（4）10000r/min离心10min，吸取上清夜，加入2/3体积的异丙醇，混匀；（5）10000r/min离心5min，弃上清夜，留下絮状沉淀，加入200～300μL70%乙醇清洗，再离心5min；（6）待乙醇挥发后，将沉淀用200μLddH2O保存于4℃下，备用（长期保存于–20℃冰箱）。

1.2.2PCR反应和电泳检测采用反应体系：10μL2×TaqPCRmixture，2μLPrimer（10μmol/L），30ngDNAtemplate，加重蒸水补足至20μL。

PCR扩增循环体系：反应条件为94℃预变性4min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸90s，45个循环；最后72℃延伸6min，于4℃保存。

PCR扩增产物在2%琼脂糖上进行电泳检测，拍照记录检测结果。

1.3数據处理

根据电泳检测结果，采用人工计数的方法读取条带并统计，同一条引物扩增出的相同条带记为数值1，无相同条带则记为0，由此构建出0-1数据矩阵。根据所得到的数据矩阵，利用NTSYSpcversion2.10e统计软件计算各香蕉种质间的遗传相似系数（coefficient），并采用该软件中的非加权组平均法（unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans，UPGMA）进行聚类分析[9]。

2结果与分析

2.1ISSR标记多态性分析

从30条ISSR引物中，筛选出清晰、稳定性高、重复性好的2条扩增条带，并呈多态性的引物（表2、图1）。2条ISSR引物在20份香蕉种质资源中，共扩增获得17条清晰的条带，条带的片段长度范围为300～2500bp，其中多态性条带共有13条，平均多态性比率为76.47%。

在17条总条带的17个位点中，航蕉1号（20号泳道）相比亲本巴西蕉（16号泳道）有4个特异性位点，另有13个相似位点，特异性位点占23.53%；航蕉2号（19号泳道）相比亲本巴西蕉有3个特异性位点，另有14个相似位点，特异性位点占17.65%。

由此可见，参试的20份香蕉种质资源具有较高的ISSR多态位点，在DNA分子水平上的遗传多样性比较丰富。同时，供试的航天香蕉材料（即航蕉1号和航蕉2号）与亲本巴西蕉之间存在明显的差异性。

2.2航天香蕉材料的遗传特异性分析

ISSR引物UBC881的扩增结果显示：在分子量为1000bp的位置，1、3～20号泳道均有1条明亮的特异性条带，仅2号柴蕉的条带较弱；7号贡蕉在分子量约为1300bp的位置无特异性条带，其他材料均有条带扩增；在分子量分别约为2000bp和2500bp的位置，19号泳道上的航蕉2号和20号泳道上的航蕉1号均无条带扩增（图1A，箭头所示位置），而其他香蕉种质，包括亲本巴西蕉（16号泳道）在此位置均有扩增产物。因此，ISSR引物UBC881可以将2个航天香蕉材料与亲本巴西蕉，以及柴蕉、贡蕉等其他18个香蕉种质区分开。

ISSR引物UBC847电泳结果显示：在分子量约为1800bp位置，2号泳道存在特异性条带缺失的现象；约800bp位置，7号泳道存在特异性条带缺失的现象；在分子量约为750bp的位置，航蕉1号（泳道20）和3号有1条较明显的亮色条带（图1B，箭头所示位置），而其他香蕉种质，包括亲本巴西蕉（16号泳道）在该位置无扩增条带。由此可见，ISSR引物UBC847可以将航天香蕉材料航蕉1号与航蕉2号，以及其他18种香蕉种质进行区分。

2.3香蕉种质资源的遗传相似系数

根据0-1数据矩阵，利用NTSYSpcversion2.10e统计软件计算各香种质间的遗传相似系数（表3）。20个供试香蕉种质间的遗传相似性系数介于0.545～1.000之间，平均遗传相似性系数为0.905。

其中华南甜蕉、漳州选、河口高把、天宝矮蕉、龙州中把、广东2号、齐尾、安定高芽、菲律宾之间，以及高脚遁地雷、威廉斯8188、索马里强、北大矮、巴西蕉之间的遗传相似性系数最大，为1.000，显示各个种质间具有较近的亲缘关系。柴蕉与贡蕉之间的遗传相似性系数最小，为0.545，说明它们彼此之间存在较大的遗传差异。

航天香蕉材料航蕉1号与航蕉2号之间的遗传相似性系数为0.952，航蕉2号与其他18个香蕉品种间的遗传相似性系数为0.667～0.909，航蕉1号与其他18个香蕉种质间的遗传相似性系数为0.636～0.870。其中航蕉1号（20号材料）与亲本巴西蕉（16号材料）的遗传相似性系数为0.833；航蕉2号（19号材料）与亲本巴西蕉的遗传相似性系数为0.870。

综上，2种航天香蕉材料之间、2种航天香蕉材料与亲本巴西蕉之间、以及2种航天香蕉材料与其他17个香蕉种质间均具有一定的遗传差异，从数值上来看，在DNA分子水平上，航蕉1号与其他18个香蕉种质的遗传差异大于航蕉2号。

2.4香蕉种质资源聚类分析

基于ISSR扩增结果，根据20份香蕉种质的遗传相似性系数，按照UPGMA法进行聚类分析得到亲缘关系树状图（图2）。从图2可以看出，设定遗传相似性系数为0.850时，供试的20份香蕉种质群体可简单地分为2个类群（Ⅰ、Ⅱ），其中类群Ⅰ仅有柴蕉1种，其他19种香蕉种质均归为类群Ⅱ，说明柴蕉与其他19种香蕉之间的亲缘关系较远。在类群Ⅱ中，当设定遗传相似性系数为0.880时，即可判断供试的目标材料航蕉1号、航蕉2号与亲本巴西蕉，以及其他16种香蕉材料的亲缘关系有较大差异。当设定遗传相似性系数为0.900时，类群Ⅱ又分为4个亚类，即航蕉1号和航蕉2号为1个亚类（Ⅱa），贡蕉为1个亚类（Ⅱb），那龙高把和那坡高把为1个亚类（Ⅱd），其他14种香蕉品种为1个亚类（Ⅱc），4个亚类之间聚类差异明显。当遗传相似性系数为0.960时，可分为8类，可看出航天香蕉材料航蕉1号和航蕉2号之间有明显的聚类差异，存在遗传多样性。而华南甜蕉、漳州选、河口高把、天宝矮蕉、龙州中把、广东2号、齐尾、安定高芽、菲律宾之间，以及高脚遁地雷、威廉斯8188、索马里强、北大矮、巴西蕉之间无明显的聚类差异，说明这些种质间亲缘关系相对较近。

3讨论

目前，ISSR分子标记技术在植物遗传育种以及种质资源研究中已得到广泛应用，范围涉及粮、油、果、蔬作物以及观赏、药用植物等。张超等[10]应用ISSR标记技术对103份裸大麦进行分析，得出裸大麦的地理分布与遗传多样性的关系。丁灿等[11]通过ISSR标记对油棕新品种进行了遗传多样性分析。赵依杰等[12]利用ISSR标记技术，鉴定了枇杷的新品种东湖早。周成城等[13]采用ISSR标记对18份樱属材料进行了有效区分和鉴定，并进一步分析了材料之间的亲缘关系。ISSR标记技术在香蕉方面的研究也有报道，包括香蕉种质资源[14-15]、遗传多样性[16-18]、亲缘关系[19-20]、品种选育[21-22]、抗病性研究[23-24]等。這些研究充分说明了ISSR分子标记技术在香蕉研究应用上的可行性。

浩瀚无际的太空已然成为人类探索研究农业生产、植物育种的新基地。本课题组所选育的2份航天香蕉材料（航蕉1号和航蕉2号）是以巴西蕉为母本，在航天空间诱变的基础上，经过连续栽培选育出来的。本研究在ISSR分子标记的层面上，从30条引物中，筛选出2条引物构建DNA数字化指纹图谱进行遗传特异性分析，得出供试的目标材料航蕉1号与航蕉2号存在特异性位点可区别于其他18份香蕉种质，航蕉1号相比亲本巴西蕉特异性位点占23.53%，航蕉2号相比亲本巴西蕉特异性位点占17.65%。航蕉1号与巴西蕉的遗传相似性系数为0.833，航蕉2号与巴西蕉的遗传相似性系数为0.870，2种航天材料与其他18份香蕉种质存在明显的聚类差异。结合田间观察，航蕉1号、航蕉2号与亲本巴西蕉在表型性状上也存在一定的差异，如植株大小、果穗果实形态、果实产量等性状。根据试验结果分析得出，航蕉1号、航蕉2号与母本巴西蕉（基因型均为AAA）三者之间，以及与其他17份香蕉种质之间存在明显的遗传特异性，研究结果为新品种的分类鉴定和保护提供了科学依据，也为香蕉种质资源的创新和新品种选育提供参考。

根据聚类分析结果，结合各香蕉种质的基因型特点，可以得出柴蕉（基因型为ABB）和贡蕉（基因型为AA）之间存在差异，同时与其他香蕉种质（基因型为AAA）之间也有明显不同的表现，可以初步说明基因型不同的香蕉种质之间亲缘关系相对较远，表现出明显的遗传差异，这与前人的研究结果[16-17]基本一致。虽然巴西蕉是2种航天香蕉材料的亲本，但是从聚类图可以看出，航蕉1号、航蕉2号与巴西蕉之间的遗传距离相对较远，说明航天搭载可使巴西蕉的遗传物质在某些特定的位点发生较大的改变，充分证明了航天搭载是一种非常行之有效的诱变育种技术，故而可从变异后代中选育出新品种[24]。但是，航蕉1号、航蕉2号与巴西蕉之间的遗传距离相对较远，以及基因型AA的贡蕉与基因型为AAA的香蕉材料未被简单地分成2类，这并不排除由于本研究为了区分2份航天香蕉目标材料与其他材料之间的遗传差异，而筛选所用的引物数量较少的原因。