基于烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）探讨红景天苷在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中的保护作用

李荣军，徐春霞，张 庭，张志红，王 缕

1 泸州市中医医院脾胃病肝病科，四川 泸州 646000

2 西南医科大学附属医院全科医学科，四川 泸州 646000

不良的生活方式及饮食习惯导致非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率迅速增长，已成为我国第一大慢性肝病和健康体检肝脏生化指标异常的首要原因［1］。最新的流行病学调查［2-3］结果显示，包括中国在内的多数亚洲国家NAFLD 患病率处于中上水平（＞25%）。红景天苷在NAFLD 中可通过改善胰岛素抵抗、抗氧化应激、抗纤维化等途径发挥保护作用［4-7］。同时，研究［8］表明，细胞内烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferas，NAMPT）具有调节肝脂质代谢的潜在作用。本研究通过建立NAFLD 模型，并以NAMPT 为切入点，探讨红景天苷在NAFLD 中的调控作用及其可能机制，以期为红景天苷的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 实验动物 SPF 级6 周龄雄性KM 小鼠24 只，体质量（30±5）g，由成都达硕实验动物有限公司提供，饲养于西南医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证编号：SCXK（川）2015-030，实验动物使用许可证编号：SYXK（川）2014-000。

1.1.2 药物制备 红景天苷（＞98%，大连美仑生物技术有限公司），批号：J1206A。用时以蒸馏水配置成浓度为10 mg/mL的药液。

1.1.3 高脂饲料 配方：82.5%普通饲料、10%猪油、5%蔗糖、2%胆固醇、0.5%胆酸钠，购自成都达硕实验动物有限公司。

1.1.4 试剂 ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C 检测试剂盒（Mindray 公司）；NAMPT、AMPKα、SERBP1 抗体、Sirt1（Affinity公司）；β-actin抗体（Abclonal公司）；Western及IP 细胞裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime公司）；预染蛋白Marker（ABClone 公司）；ECL 发光试剂盒（Affinity 公司）；Immobilon-PSQ PVDF 膜（Sigmaaldrich公司）；PAGE 凝胶快速制备试剂盒（上海雅酶生物科技有限公司）；Glycine（Biofroxx 公司）；Tris 缓冲液、SDS（Biofroxx公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及造模 将小鼠适应性喂养1周，随机分为正常组（普通饲料喂养）、高脂饮食（HFD）组、HFD+空白对照组、HFD+红景天苷组，每组6只。HFD组通过高脂饲料喂养14 周建立NAFLD 动物模型，14 周末以HFD 组小鼠肝脏病理切片中出现大小不一的脂滴和气球样变为造模成功标准。在14周末开始给予HFD+红景天苷组小鼠100 mg·kg-1·d-1红景天苷灌胃处理8 周，HFD+空白对照组小鼠以同等体积的生理盐水作为对照，给药期间各组小鼠喂养方式不变。

1.2.2 获取标本 22 周末，禁食24 h 后称重，处死小鼠，打开腹腔，腹主动脉采血，收集血液样品并分离血清；部分肝组织用多聚甲醛液（4%）固定，常规石蜡包埋、切片、HE 染色在光学显微镜下观察肝细胞形态、脂质沉积等病理学变化，通过NAFLD 活动度积分（NAFLD activity score，NAS）评价各组小鼠肝组织脂肪变性、小叶炎症和气球样变程度［9］，评分越高表明脂肪变性、小叶炎症、气球样变程度越高（表1）。剩余肝组织置于-80 ℃保存，用于Western Blot检测。

表1 NAS评分标准Table 1 NAS scoring criteria for liver tissue

1.2.3 ELISA法测定血清生化指标 取小鼠血清样本，按照各指标ELISA 试剂盒说明书进行ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C等相关生化指标测量。

1.2.4 Western Blot 法检测肝组织内NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1表达 取小鼠肝脏样本，向每管加入RIPA裂解液，用灭菌剪刀将组织剪碎，置碎冰上裂解10 min；收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min；离心后取上清液，用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。BCA 定量后将蛋白浓度调至10 μg/μL，上样40 μg，经凝胶电泳分离后转至PVDF 膜上，5% BSA 室温下封闭2 h，分别加入兔抗NAMPT 抗体（1∶1 000）；AMPKα 抗体（1∶1 000）；SERBP1抗体（1∶1 000）；Sirt1抗体（1∶1 000）；鼠抗β-actin抗体（1∶100 000），4 ℃过夜，第二天经过TBST 充分漂洗后加入HRP标记的羊抗兔抗体（1∶5 000），室温孵育2 h，经TBST充分漂洗后，ECL发光显影。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NAFLD小鼠模型建立 正常组小鼠肝组织中央静脉周围肝细胞呈放射状分布，单行排列，形态一致，细胞核圆且居中，胞浆均匀分布；HFD 组小鼠肝索排列紊乱，肝细胞体积明显增大且胞质染色变浅（部分呈现透明），出现“气球样”变，部分细胞核被挤压于一侧，汇管区周围有炎症细胞浸润，提示NAFLD模型建立成功（图1）。

图1 各组小鼠肝组织病理形态学变化（HE染色，×100）Figure 1 Pathological changes of liver tissue in mice of each group（HE staining，×100）

2.2 红景天苷对KM 小鼠血清生化指标的影响 与正常组比较，HFD 组及HFD+空白对照组的血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C 水平明显升高（P值均＜0.05），而HDL-C 明显降低（P＜0.05）；HFD+红景天苷组血清AST、TC 水平明显高于正常组（P值均＜0.05）。与HFD组及HFD+空白对照组相比，HFD+红景天苷组小鼠血清ALT、AST、TG、LDL-C 水平明显降低（P值均＜0.05），而HDL-C 明显升高（P＜0.05）（表2）。

表2 红景天苷对KM小鼠血清生化指标的影响Table 2 The effect of Salidroside on serum biochemical indicators in KM mice

2.3 各组小鼠肝组织病理变化比较 正常组小鼠肝组织结构完整，中央静脉周围的肝细胞形态一致、呈有序单行条索状排列、放射状分布，胞核圆且居中，胞浆分布均匀；与正常组比较，HFD 组及HFD+空白对照组小鼠肝组织可观察到明显的脂肪变性、小叶炎症、气球样变等病理变化，NAS 评分明显升高（P值均＜0.01）；与HFD 组及HFD+空白对照组比较，HFD+红景天苷组小鼠肝组织损伤程度明显减轻，肝细胞结构排列较为完整有序，肝组织脂肪蓄积及细胞空泡化得到明显改善，脂肪空泡数量明显减少，NAS 评分降低（P值均＜0.01）（图2，表3）。

图2 各组小鼠肝脏组织HE染色Figure 2 Pathological changes of liver tissue in mice of each group

表3 各组小鼠肝组织NAS评分Table 3 The NAS score of liver tissue in mice of each group

2.4 各组小鼠肝组织NAMPT、AMPKα、Sirt1、SREBP1 蛋白表达比较 与正常组相比，HDF组及HDF+空白对照组小鼠肝组织中NAMPT、AMPKα、Sirt1蛋白表达显著降低（P值均＜0.05），而经过红景天苷处理的小鼠肝脏NAMPT、AMPKα、Sirt1 蛋白表达明显高于HDF 组、HDF+空白对照组（P值均＜0.05），同时HDF+红景天苷组AMPKα 低于正常组（P＜0.05）。HDF 组以及HDF+空白对照组可明显上调SREBP1 的表达，与正常组比较差异具有统计学意义（P值均＜0.01），经过红景天苷处理的小鼠肝脏SREBP1 表达较HDF 组以及HDF+空白对照组明显减少（P＜0.01）（图3、4）。

图3 各组小鼠肝组织NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1蛋白表达Figure 3 The hepatic protein expression of NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1 in mice of each group

图4 红景天苷对NAFLD小鼠肝脏NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1表达的影响Figure 4 The effect of salidroside on the hepatic protein expression of NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1 in mice of each group

3 讨论

红景天苷为红景天提取物，是景天科红景天属的多年生草本植物，分子式：C14H20O7，在《四部医典》和《本草纲目》均有记载。研究［10-14］证明红景天苷有提高机体免疫力、增强体质、改善人体造血机能、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、降血糖、抗病毒、抗辐射、预防高原反应等多种功能。此外，戴宁等［15］研究显示红景天苷对高脂高胆固醇饮食诱导的NASH 有较好的抑制效果，其机制可能与红景天苷的抗氧化作用有关；陈少东等［4］研究发现，红景天苷能明显降低NAFLD 血清TG 水平及AST 活性，改善肝组织脂肪变性的病理状态，具有显著减轻NASH病理损伤的药理效应。张新茹［16］研究报道，红景天苷能显著降低高脂饮食联合链脲佐菌素诱导的2型糖尿病小鼠的血脂、减少肝脏中的脂质沉积。本研究结果显示，高脂饲料诱导的NAFLD 模型组血生化指标中ALT、AST、TG、TC、LDL-C 均明显升高，且AST、TG 升高明显，同时导致肝组织明显脂肪变性，提示存在明显的NASH表现，而经过红景天苷治疗后，ALT、AST、TG、LDL-C 均明显下降，肝脂肪变程度明显改善，提示红景天苷具有改善NAFLD 小鼠的脂代谢、肝功能、肝脂肪变性的作用，存在改善NAFLD 的潜力，进一步证实了红景天苷防治NAFLD、高血脂等方面的疗效。

国内研究［17］显示人群的NAFLD 患病率为13%～43%，且NAFLD 患病率呈逐年上升趋势，每年新发NAFLD的人数比例约为4%。其中非肥胖NAFLD也有一定的患病率，其主要的危险因素包括甘油三酯的蓄积、遗传因素、不良的生活方式、糖尿病、高尿酸血症、高雄激素血症、药物性脂肪肝等［18］，不仅最终可能进展为晚期肝病（包括失代偿性肝硬化和肝细胞癌），其与代谢综合征、2型糖尿病、动脉粥样硬化性心血管疾病以及结直肠肿瘤等的高发密切相关［19］。NAFLD 最显著的特征是甘油三酯在肝脏中的积累。据报道［15］，脂质合成异常是肝脏异常脂质沉积的主要原因之一。NAMPT 是一种高度保守的52 kD 蛋白质，在哺乳动物中具有细胞内（iNAMPT）和细胞外形式（eNAMPT）。NAMPT是细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的重要调节因子，是调节来自哺乳动物NAM 转变为NAD+补救途径中的限速步骤［20］。研究［8］表明，NAMPT在体内和体外肝脂肪变性模型中发挥了关键作用，NAMPT通过激活NAD+补救途径促进NAD+的产生，增加的NAD+作为底物激活Sirt1信号通路，一方面Sirt1的活化直接促进SREBP1的脱乙酰化，导致SREBP1活性抑制；另一方面，Sirt1 通过激活AMPKα，间接抑制SREBP1活性。SREBP1 活性的抑制最终导致包括FASN 和ACC在内的脂肪生成基因表达的抑制，从而减轻高脂饮食诱导的小鼠肝脂肪变性［21-22］。本研究结果显示，与正常组相比，高脂饮食诱导的NAFLD 模型组，NAMPT、Sirt1、AMPKα 表达明显减少，且SREBP1 表达增加，提示高脂饮食可通过NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1 信号通路，促进脂质合成且沉积于肝脏，从而导致NAFLD。经过红景天苷干预后NAFLD小鼠肝组织NAMPT、Sirt1、AMPKα蛋白表达升高，SREBP1的表达减少，由此推断红景天苷可通过上调NAMPT、Sirt1、AMPKα，抑制SREBP1 活性，最终导致其下游脂肪生成受抑，减轻高脂肪饮食诱导的小鼠肝脂肪变性，发挥其对NAFLD的保护作用。

综上，红景天苷可明显改善NAFLD 小鼠血液生化指标，保护肝脏功能，降低血液中血脂含量，并可通过促进NAMPT、Sirt1、AMPK的表达，减少SERBP1的表达，发挥其对NAFLD 的保护作用。通过本研究进一步阐明红景天苷在NAFLD 中的作用及其可能机制，为红景天苷相关产品的进一步开发以及找寻防治NAFLD 药物新靶点具有重要的科学和社会意义。

伦理学声明：本研究方案于2021年9月29日经由西南医科大学实验动物福利伦理委员会审批，批号：20210929-013，符合实验室动物管理与使用准则。

利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明：王缕、李荣军、张志红负责课题设计；王缕、张庭负责饲养动物，造模，处理动物获得标本；王缕负责Western Blot、ELISA、病理组织学相关试验；徐春霞负责资料分析；李荣军、张志红负责拟定写作思路；李荣军、王缕负责撰写论文，修改论文，最后定稿。