饲料中虾青素对凡纳滨对虾雌虾肝胰腺脂代谢和卵巢发育的影响

吴亚顺 徐 斌刘嘉欣罗 智宋玉峰

(1.华中农业大学水产学院,分子营养实验室,武汉 430070;2.广东海大集团股份有限公司,广州 511400)

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是我国最重要的对虾养殖品种之一,其全身呈不具斑纹的浅青灰色。根据《2022年中国渔业统计年鉴》,2021年全国凡纳滨对虾养殖总产量为197.74万吨,占我国对虾养殖总量的68.4%[1]。凡纳滨对虾的产业发展主要受限于种苗质量,目前国内凡纳滨对虾亲虾一般为进口亲虾,国产亲虾在市场的认可度仍有待提升。亲虾繁育期间的营养来源也是影响凡纳滨对虾产业发展的重要因素。传统上,亲虾繁育期间的饵料体系仍然依赖于各种生鲜和冷冻食品,如沙蚕。然而,沙蚕作为凡纳滨对虾亲虾繁育过程中的主要生物饵料,存在易腐烂、质量参差不齐和易携带致病菌等问题。目前,市场上仍缺乏适合亲虾的高质量配合饲料。

类胡萝卜素是提高营养利用率和促进亲本生长的重要物质,缺乏类胡萝卜素会降低亲本和幼体的质量[2]。虾青素是一种红色类胡萝卜素,也是一种强抗氧化剂[3]。先前研究已经证明了虾青素能改善甲壳动物的色素沉着、抗氧化活性、免疫能力和抗胁迫能力[4]。例如,添加虾青素能改善三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)机体色泽,提高雌蟹的免疫性能和抗氧化能力[5];提高凡纳滨对虾的生长、抗氧化能力、免疫能力和胁迫耐受力[6,7]。已有研究表明,细胞内氧化还原平衡的变化可以改变脂质代谢[8]。事实上,氧化应激与脂肪组织中脂质积累有关[9,10]。脂肪酸代谢对于凡纳滨对虾雌虾来说更是重中之重,卵巢发育和卵黄颗粒的积累需要大量脂质,而有研究指出,卵巢中脂质是由肝胰腺分泌到血淋巴,通过极低密度脂蛋白(Very low-density lipoprotein,VLDL)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)和高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)运输到性腺[11]。近年来研究发现,虾青素还能提高水产动物亲本的繁殖性能[4],在斑节对虾(Penaeus monodon)日粮中添加虾青素能增加性腺成熟度和产卵成功率[12]。最新研究显示,虾青素能提高凡纳滨对虾卵黄蛋白含量、孵化率和幼体变态率,从而提高雌虾的繁殖性能[13],但未阐明其具体影响机制。基于此,本试验旨在探讨饲料中添加天然虾青素对凡纳滨对虾雌虾脂代谢和繁殖性能的影响,并通过转录组测序技术进一步分析筛选出在虾青素作用下雌虾卵巢的差异表达基因,以期揭示凡纳滨对虾中虾青素代谢调控和生理过程。

1 材料与方法

1.1 实验饲料

本试验以虾青素含量3%的雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)为原料,按照0(A0)、40(A40)、80(A80)和120(A120) mg/kg的虾青素浓度梯度,配制4种等氮等能的软颗粒试验饲料,试验饲料原料均来源于广东海大集团,试验饲料的组成和营养水平见表1。试验用凡纳滨对虾雌虾来源于海南省文昌市海兴农虾苗场,暂养在黑色方形池中(长×宽×高=6 m×6 m×1.2 m),期间饲喂生物饵料。暂养结束后,采用镊烫法摘除180尾健康雌虾[平均体重:(65±5) g]的单侧眼柄进行促熟,并与雄虾[平均体重:(50±5) g]按1∶1比例分别随机分配到12个养殖桶(900 L水,每个养殖桶15尾虾)中,每组3个重复。养殖期间采用定量投喂法,根据生产模式做出一定调整,每天投喂6次,其中9:00、14:30和21:00投喂沙蚕,9: 00和21: 00投喂量为5%,14:30投喂量为2%;12:00和24:00投喂鱿鱼,投喂量为1.5%;2:30投喂试验料,投喂量为1%。每天换水2次,换水量为80%。水质参数控制在水温28—29℃,pH 7.8—8.4,盐度30—32,溶解氧5—6 mg/L,氨氮0.50—1.00 mg/L,亚硝酸盐0.50—1.00 mg/L,并保持24h黑暗光周期。在养殖过程中记录每天受精和产卵雌虾尾数,并在试验结束前对雌虾产卵量进行统计。

表1 四种试验配合饲料饲喂凡纳滨对虾的成分配方Tab.1 Formulation and chemical composition of four experimental forLitopenaeus vannamei

1.2 孵化管理

在养殖试验过程中,每天10: 00挑选性腺成熟的雌虾(性腺发育为V期)放入相对应试验组雄虾池中进行自然交配,19: 00检查雄虾中雌虾交配情况,将受精成功的雌虾放入1 m3的产卵池中产卵,水温30.5℃,不充氧,受精失败的雌虾则放回原池。21:30检查产卵情况,将已产卵雌虾放回原池,产卵池中微充气,且每隔0.5h推1次卵至翌日10点,未产卵雌虾至23: 30放回虾池,统计每天交配和产卵亲虾尾数。00: 00统计产卵量,翌日10: 00统计无节幼体数量。统计产卵量、无节幼体数量时,先混匀水体,使无节幼体均匀分布于水中,用烧杯从产卵池中舀取100 mL,统计烧杯内卵或幼体数量,重复3次并计算平均值,按照烧杯与孵化池的比例计算出每尾虾的总产卵量。

1.3 样品采集与测定

养殖30d后,将虾禁食24h,在冰浴中麻醉10min后取样。首先分别测定体长和体重,然后在冰上剖取性腺和肝胰腺分别称重,用于计算性腺指数(Hepatosomatic index,HSI)和肝胰腺指数(Gonadosomatic index,GSI)。肝胰腺和卵巢分离立即冷冻在液氮中,然后在-80℃保存以备后续分析。

试验饲料送至海大研究院(广东海大集团股份有限公司)进行测定,肝胰腺脂肪酸成分、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、超氧化物歧化酶(T-SOD)、总抗氧化(T-AOC)参考实验室方法[14,15]。高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和极低密度脂蛋白(VLDL)采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定,丙二醛(MDA)采用碧云天生物技术有限公司试剂盒进行测定,使用雌二醇酶联免疫试剂盒(北京北方生物技术研究所有限公司,中国)测定雌二醇,具体操作步骤按说明书进行。

1.4 肝胰腺和卵巢组织HE切片

参考Zhong等[14]的方法进行石蜡切片和HE染色,光学显微镜观察肝胰腺和卵巢组织结构,并用image J计算卵母细胞面积。

1.5 卵巢转录组分析

本研究委托上海派森诺生物科技有限公司对四个试验卵巢样本进行RNA提取、质控、文库构建(NEBNext®Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina®,NEB,USA)和测序。在Illumina NovaSeq平台上,采用150 bp的配对末端读数对文库进行测序。对原始数据进行质控处理,得到干净的数据,并计算其Q20和Q30。利用参考基因组索引,将paired-end clean reads比对到凡纳滨对虾转录组序列(NCBI TSA登录号: PRJNA908249)。计算每个基因的读数,并根据基因长度和读数计算每个基因的FPKM值。在差异表达分析前,使用edgeR程序包进行单比例归一化。采用DEseq软件,以P＜0.05和FC＞2为筛选标准,筛选出差异表达基因。使用Cluster Profiler R包对差异表达基因在KEGG途径中的富集情况进行统计分析。

1.6 qPCR验证

从测序结果中选取差异表达基因进行qPCR验证。根据已有文献[15],采用荧光定量PCR检测基因表达。选用双内参18S rRNA和β-actin对基因进行标准化,并利用2-ΔΔCt法分析基因的相对表达量,与转录组测序数据进行比较分析。

1.7 统计分析

试验数据用SPSS22.0软件进行处理,结果以平均值±标准误(mean±SE)表示。采用单因素方差分析和Duncan多重检验,不同字母表示组织间有显著差异(P＜0.05)。

计算公式如下:

增重率(WGR,%)=100×(末重－初重)/初重

性腺指数(GSI)=100×(性腺湿重/体湿重)

肝胰腺指数(HSI)=100×(肝胰腺湿重/体湿重)

孵化率(HR,%)=100×(无节幼体数量/产卵量)

2 结果

2.1 虾青素对凡纳滨对虾雌虾肝胰腺的影响

对生长和生理生化的影响肝胰腺切片如图1a,A120组肝胰腺颜色偏白,发生萎缩,有些破裂。而A80组颜色及结构均正常,并且A120组R细胞(存储细胞)和B细胞(分泌细胞)较A80组明显减少。生长和生理生化指标如图1b—g,在A80组中雌虾增重率显著升高(P＜0.05),其他组较对照组无显著差异(P＞0.05)。雌虾的肝胰腺指数无显著性影响(P＞0.05)。雌虾肝胰腺中甘油三酯和胆固醇在A80组和A120组显著下降(P＜0.05)。低密度脂蛋白胆固醇在A80组显著下降(P＜0.05),其他试验组较对照组间无显著影响,而高密度脂蛋白胆固醇无显著影响(P＞0.05)。

图1 虾青素对肝胰腺组织结构、抗氧化能力和脂代谢的影响Fig.1 Effects of astaxanthin on hepatopancreas tissue structure,antioxidant capacity and lipid metabolism

对抗氧化能力的影响MDA在A80组较A120组显著下降,试验组中T-AOC均显著升高(P＜0.05),且在A80组达到最高值(图1h—j)。TSOD在A40组和A80组显著升高(P＜0.05),A120组无显著影响(P＞0.05)。

对脂肪酸组成的影响脂肪酸组成如图1k,日粮饲料中A80组较A40组和A120组显著降低肝胰腺中饱和脂肪酸(SFA)的比例(P＜0.05),与对照组间无显著差异(P＞0.05)。其中,A80组C20∶0的比例较其他组显著下降(P＜0.05)。随着虾青素含量的升高,∑n-3 PUFA在A120组显著升高(P＜0.05),而对∑n-6 PUFA没有显著影响(P＞0.05)。在A80组中,MUFA、EPA(C20∶5n-3)和ARA(C20∶4n-6)较A0组显著升高(P＜0.05)。

对脂代谢的影响在脂质合成相关基因中,如图1l,3组试验组中脂肪酸合成酶(fas)、固醇调节元件结合蛋白1(srebp1)的mRNA表达水平较对照组均显著降低(P＜0.05),乙酰辅酶A羧化酶(acc1)无显著变化(P＞0.05)。在脂肪酸吸收转运相关基因中,脂肪酸结合蛋白1(fabp1)均显著升高(P＜0.05),且在A80组达到最高值。脂肪酸转运蛋白(fatp)在A80组显著升高(P＜0.05),A40组和A120组无显著影响(P＞0.05)。

2.2 虾青素对雌虾卵巢发育和繁殖性能的影响

对卵巢发育的影响卵巢HE切片如图2a,计算卵巢中单个卵母细胞的平均面积,如图2b。结果显示,在A80组卵细胞个体面积最大(P＜0.05)。对雌激素生成的影响如图2c—e,胆固醇在A40组和A80组显著升高(P＜0.05),在A120组无显著影响(P＞0.05)。在极低密度脂蛋白中,试验组较对照组均显著升高(P＜0.05)。雌二醇含量在A40组显著升高(P＜0.05),在A80组无显著影响(P＞0.05),而在A120组显著下降(P＜0.05)。

图2 虾青素对卵巢发育和繁殖性能的影响Fig.2 Effects of astaxanthin on ovarian development and reproductive performance

对繁殖性能及后代的影响添加不同水平虾青素的繁殖性能和对后代质量的影响如图2f—i所示,性腺指数和平均产卵量在A80组显著升高(P＜0.05),其他组无显著影响(P＞0.05)。无节幼体量均显著升高(P＜0.05),且在A80组达到最高值。孵化率在四组之间均无显著差异(P＞0.05)。

2.3 转录组分析虾青素对卵巢发育的影响

转录组注释及差异表达基因KEGG富集分析

本研究构建凡纳滨对虾试验组(A40、A80和A120)和对照组(A0)性腺组织共12个样本的转录组文库,Q20碱基百分比在98.03以上,说明测序结果质量较好。虾青素饲喂凡纳滨对虾卵巢差异表达基因的统计结果如图3a,韦恩图如图3b。A40组与A0组之间有114个上调基因,216个下调基因;A80组中,共鉴定出149个上调基因,91个下调基因;A120组中,共鉴定出140个上调基因,228个下调基因。通过KEGG数据库进行功能富集分析,选取了各比较组间富集最显著的10个代谢通路,并绘制相应的KEGG富集柱状图(图3c—d)。在A80组的前10个富集通路中,“D-氨基酸代谢”“细胞色素P450代谢异生素”“视黄醇代谢”等显著富集(P＜0.05),在A120组的前10个富集通路中,“卟啉代谢”“溶酶体”“类固醇激素生物合成”等显著富集(P＜0.05)。对照组和试验组之间的富集通路相比,最富集的共同途径是“细胞色素P450代谢异生素”“类固醇激素合成”“视黄醇代谢”和“甘油磷脂代谢”,表明在饲喂虾青素后,这些通路在性腺组织中产生显著变化。

图3 转录组分析虾青素对卵巢发育的影响Fig.3 Transcriptome analysis of the effects of astaxanthin on ovarian development

差异基因表达筛选为进一步探究不同虾青素水平对于凡纳滨对虾雌虾性腺的影响机制,基于功能基因注释,本研究进一步从差异表达基因中筛选出氨基酸、脂质和激素相关基因(图3e—g)。脂代谢相关基因包括磷脂酶A(Phospholipase-like protein A2,group;pla2)和谷胱甘肽S-转移酶样(Glutathione S-transferase class-mu 26 kD isozyme 47-like,gst)。研究发现了激素相关基因,包括细胞周期蛋白样(Cyclin-B2-1-like,cycb1/4)、法尼苏酸甲酯环氧化物酶样(Methyl farnesoate epoxidase-like,mfe)。此外,与A0组相比,A80组gst显著上调(P＜0.05),而在A120组中无显著差异(P＞0.05)。差异表达基因pla2在花生四烯酸代谢信号通路中显著富集(P＜0.05),在A80组中显著升高(P＜0.05)。差异表达基因cycb1/4、磷脂酶D(Phospholipase D3-like,pld1/2)富集在卵母细胞减数分裂信号通路、花生四烯酸代谢信号通路中,并在A120组中下调表达。

荧光定量PCR验证DEGs为了验证转录组数据的可靠性,本研究在卵巢发育相关差异基因中,筛选差异基因进行qPCR验证(图3h—i)。验证结果与转录组相应基因表达水平基本一致,表明基于转录组数据分析结果可靠。基于对所有结果的分析,本研究 提出甘油磷脂代谢、胆固醇转运和氨基酸代谢参与类固醇激素的合成,最终促进对虾卵巢发育(图4)。

图4 虾青素对卵巢发育影响机制图Fig.4 Mechanism diagram of the effect of astaxanthin on ovarian development

3 讨论

3.1 饲料中虾青素含量对雌虾生长及繁殖性能的影响

虾青素是一种对水产养殖动物具有促进生长和提高繁殖性能的物质。在本研究中,A80组能显著提高雌虾的增重率,而在A40组和A120组增重率无显著变化。以往研究表明,饲料中添加适量虾青素可提高乌鳢(Channa argus)[16]、泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)[17]和克氏原螯虾(Procambarus clarkii)[18]的生长性能。但是,虾青素对生物体的促进作用并不会随着饲料中虾青素含量的增加而增强。Jagruthi等[19]实验结果显示,饲喂50和100 mg/kg虾青素能明显提高鲤的增重率,而50 mg/kg的试验组的增重效果是最为可观。还有研究表明,低浓度虾青素(50—150 mg/kg)会提高棘颊雀鲷(Premnas biaculeatus)的增重率,而高浓度虾青素(200 mg/kg)则会抑制其生长[20]。因此,虾青素能促进水产养殖动物生长,但不会随着饲料中虾青素含量的增加而增强。

雌虾繁殖性能包括性腺指数、性激素水平和产卵量等指标。本研究发现,在A80组雌虾的性腺指数、产卵量和卵母细胞面积显著高于对照组,而在A120组中雌二醇含量显著降低。以往研究表明,适宜浓度虾青素可以促进小鼠颗粒细胞增殖、卵泡面积增大、卵母细胞发育[21];提高卵泡中雌二醇合成分泌、降低孕酮合成分泌[22];改善鲑鱼受精率、卵质、生长发育[23]。因此,虾青素可能通过影响颗粒细胞增殖和激素水平来提高雌虾繁殖性能,且添加80 mg/kg虾青素最为适宜。

3.2 饲料中虾青素含量对雌虾肝胰腺脂代谢的影响

对于甲壳动物来说,肝胰腺是机体脂肪代谢调控的重要靶器官。脂肪酸在体内的从头合成过程中通常受到脂肪合成酶的催化,而脂肪合成酶又受到脂肪合成代谢的关键转录因子srebp1的调控[24]。在本研究中,结果表明添加虾青素能降低脂肪酸合成相关基因srebp1和fas,从而来降低肝胰腺组织中的脂肪沉积。已有研究也表明,添加虾青素能促进红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的生长性能,并能抑制fas等脂质合成基因的表达,降低脂质沉积[25],这与本研究结果基本一致。脂肪酸结合蛋白(fabp1)和脂肪酸转运蛋白(fatp)对游离脂肪酸的摄取与吸收具有重要作用,同时脂肪酸结合蛋白也可以将脂肪酸转运至线粒体内进行氧化分解功能[26]。本研究A80组中fabp1和fatp随着虾青素浓度的升高显著上调,该结果说明饲料中添加80 mg/kg虾青素能显著促进脂肪酸吸收转运过程,从而促进凡纳滨对虾的生长。

许多研究表明,∑SFA与LDL-C的浓度息息相关,∑SFA摄入量的增加与LDL-C浓度的升高有关[27]。∑SFA的增加能提高生物体中LDL-C的含量,诱导胰岛素抵抗,促进炎症的发生[28]。在肝胰腺中,添加80 mg/kg虾青素可以降低饱和脂肪酸(SFA)的含量,这与LDL-C的变化趋势一致。在本研究中,添加虾青素不影响脂肪酸的前体水平,但由于高不饱和脂肪酸容易被氧化,饲喂虾青素的肝胰脏中MUFA、∑n-3 PUFA和ARA水平较高的原因可能在于虾青素具有较强的抗氧化活性[29]。

3.3 凡纳滨对虾卵巢转录组分析

在水产动物的研究中,转录组测序技术已经被广泛应用,涵盖生长发育、免疫、进化和环境胁迫等方面。KEGG富集分析显示,许多DEGs集中在花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢和类固醇激素合成等通路。ARA是前列腺素的前体物质[30],在许多水生物种的繁殖中起关键作用[31]。研究表明ARA介导哺乳动物类固醇激素的生物合成。在大鼠睾丸间质细胞上研究发现,抑制ARA从磷脂膜上的释放会抑制LH合成,这证实了ARA参与类固醇激素合成[32]。磷脂酶A2 (pla2)可以从细胞磷脂中调动ARA。然后,游离ARA通过CYP450途径被氧化,生成前列腺素[33]。前列腺素可以促进许多十足类甲壳类动物的卵巢成熟,包括卵黄发生和产卵[34]。在罗氏沼虾中卵巢前列腺素浓度与卵黄发育呈正相关[34]。基于以上分析,虾摄取虾青素后ARA代谢被激活。因此推测虾摄取虾青素后增加了ARA代谢活性,并通过相关因子促进了前列腺素合成从而加速了凡纳滨对虾卵巢发育。

除上述代谢相关的DEGs外,还有部分DEGs富集在谷胱甘肽和氨基酸代谢相关通路中。在卵母细胞中,谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂,可以保护卵母细胞免受活性氧自由基的损伤。Li等[35]的研究表明,在培养基中添加谷胱甘肽或半胱氨酸可以降低猪胚胎卵母细胞的裂解,增加囊胚的形成率,降低卵母细胞内的活性氧水平和细胞凋亡指数,提高卵母细胞和囊胚的质量和发育能力。本研究发现,在A80组中,虾青素能够通过上调prdx6和gst等抗氧化相关基因来增强卵母细胞的抗氧化能力,降低机体中ROS水平,从而促进维持卵泡生成、卵母细胞成熟和排卵,这与Li等[35]结果一致。氨基酸在各种生理过程中扮演重要角色,膳食氨基酸摄入量会影响某些激素的释放[36]。氨基酸是卵巢发育的必需营养素之一,可以促进卵黄蛋白、激素多肽和酶的合成,进而促进卵巢成熟和生殖。牛磺酸是一种由半胱氨酸转化而来的氨基酸[37],具有调节雌性生殖激素分泌和下丘脑-垂体-卵巢轴相关激素活性等功能[38,39]。牛磺酸通过激活机体p38信号通路促进miR-7a表达,从而促进雌激素合成[40]。在本研究中,A80组gadl1mRNA表达量显著增加,而A120组无显著影响,上述结果表明,添加虾青素能够通过增加牛磺酸含量,从而增加卵巢中雌二醇含量,进而促进卵巢发育。总之,本研究揭示了虾青素通过调节抗氧化水平和氨基酸代谢来改善卵巢的发育和繁殖能力。

综上所述,本研究以凡纳滨对虾为对象,研究虾青素对雌虾抗氧化能力、脂代谢、性腺发育及生产性能的影响。结果表明,添加80 mg/kg虾青素可促进生长发育和抗氧化能力,并提高性腺发育性能。然而,120 mg/kg虾青素未能进一步增强效果。该效果为探究虾青素对凡纳滨对虾雌虾卵巢发育的影响机制提供新线索。