鲍曼不动杆菌耐药基因及检测手段

朱奕衡 竭晶 宋磊 罗招庆

(吉林大学第一医院 1感染与免疫中心,吉林 长春 130021;2呼吸与危重症医学科)

鲍曼不动杆菌是一种普遍存在的革兰阴性需氧球杆菌。由于基因组可塑性强,在遗传学水平上鲍曼不动杆菌的不同分离株之间存在高度异质性〔1,2〕。作为“逃逸”菌株之一,鲍曼不动杆菌拥有多重耐药性和很强的抗逆性,从而避免抗菌剂的作用。由于其对大肠杆菌素,替加环素和碳青霉烯类等最后抗生素方案的耐药性,因而被世界卫生组织和美国疾病控制和预防中心列为“高度优先”,成为最具有威胁性的ESKAPE病原体之一〔3〕。其可以透过皮肤或呼吸道缺陷的病人进行传播,也会经由重症监护室中呼吸机呼吸的患者进行进一步的院内传播,老年人因多重耐药鲍曼不动杆菌引起的菌血症使得其死亡风险增加近5倍,鲍曼菌血症是引起30 d住院死亡率最高的独立危险因素,因此鲍曼不动杆菌感染成为重症监护患者或易受感染患者的主要风险因素。鲍曼不动杆菌感染一般会引起皮肤,软组织或伤口感染、菌血症、心内膜炎、尿路感染、脑膜炎和肺炎。鲍曼不动杆菌的血液感染导致的死亡率为28%～43%〔4,5〕。本文总结了目前药物抗菌活性的常用测定方法,并对鲍曼不动杆菌耐药基因及检测方法的研究进展进行综述,以期为研究鲍曼不动杆菌感染的临床与科研工作者做参考。

1 鲍曼不动杆菌的抗药性检测

2.1体外抗菌活性的测定 体外抗菌活性测定可以直接评估抗菌药物的有效性,并确定抗菌剂对相应菌株的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。目前有大量的方法用于确定病原体对于何种抗生素敏感,这些方法被统称为抗微生物药敏试验。

上述技术都是基于微生物生长表型进行的,是普遍表型敏感性测试,这种方式具有普适性,机制已知且独立具有明确的表型分类。但这种检测手段依赖细菌的生长和相关产物的表达,因而需要不断摸索合适的实验条件及检测手段。现如今已经开发出多种检测手段包括但不限于以下方法:圆盘管法〔6〕:基于生长介质浊度评估;pH指示剂比色法〔7〕:含酚红指示剂培养基中测定细菌生长;氧化还原剂比色法〔8〕:含氧化还原指示剂培养基中测定细菌生长;培养盘扩散法〔9〕:短暂孵育到含抗菌剂的培养盘中对抑制区进行视觉评估;微流琼脂糖通道系统〔10〕:微流体通道中固定在琼脂糖基质中的细菌并使用显微镜检测单个细胞生长;前向激光散射〔11〕:使用激光的散射率测定细菌生长;数字延时显微镜〔12〕:液体样品中的连续成像光学检测;微生物细胞质量测量〔13〕:通过微通道测定细菌生长;恒温微量热测定〔14〕:通过产热测定细菌生长;实时聚合酶链反应(PCR)〔15〕:在液体培养基中孵育后实时定量测定16 S RNA基因或rpoB的DNA拷贝;ATP荧光定量〔16〕:荧光素-荧光素酶与细菌ATP反应生成光,通过此测定细菌生长;荧光素酶报告噬菌体〔17〕:使用包含荧光素酶报告基因的噬菌体感染细菌,通过定量光的程度推定细菌生长程度;形态动力学细胞分析〔18〕:将细菌固定在平面并用数字显微镜记录微生物对单一浓度抗生素的反应;流式细胞术〔19〕:通过评估细胞形态功能等参数判别药物对细菌的损伤;MALDI-TOF MS直接靶向微滴生长测定〔20〕:将微生物作为微滴培养在MALDI靶上并使用MALDI-TOF MS测量。

另一类是特定抗性机制的检测,常见方法是以靶向耐药基因或序列进行DNA扩增法,免疫色谱分析或抗生素降解分析检测特定的耐药机制。抗生素降解分析主要是通过比色或基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)完成〔21〕。以上方法特点是可以快速筛选出特定的抗生素抗性并可以确定对应抗生素抗性的机制,但对于某些抗生素如碳青霉烯类抗生素透性升高或降低,难以通过该方法检测。以上方法敏感性和特异性不能达到100%,即阴性的结果并不意味着对检测的抗生素敏感,阳性结果也无法证明对相应的抗生素有抗性〔22〕。

通过全基因组测序(WGS)进行多种单一耐药测检测仍有问题亟待解决:对于单一抗生素的耐药基因,是否了解的全面且可靠,对于耐药基因的检测是否足够灵敏专一。虽然通过机器学习算法和通过RNA测序检测基因表达水平等方法已经开始研究并被用于改进全基因组测序,但这些方法仍无法取代普遍的表型敏感性测试〔23〕。

2.2耐药基因的获取机制和定位 鲍曼不动杆菌株中有着多种耐药机制,如β-内酰胺酶、氨基糖苷修饰酶、外排泵、渗透性缺陷和靶位点修饰等。鲍曼不动杆菌抗药基因产生机制主要包含3种:一是通过酶修饰抗菌药物,这其中包含氨基糖苷修饰酶(AMEs)介导的抗药产生,使细菌获得氨基糖苷类抗生素抗药性;另一种是碳青霉烯水解D类(CHDL)β-内酰胺酶介导的抗药产生,使细菌获得β-内酰胺类,碳青霉烯类,头孢菌素类,青霉素类抗生素抗药性。第二种抗药产生机制是改变目标靶点或细胞功能,这其中包含修饰宿主细胞包膜结构,主要通过改变磷脂酶作用,改变脂质和多糖,改变生物膜的形成或产生多种包括激活多种生物反应调节剂(TCS)包括AdeRS、BaeSR、pmrAB、BfmRS、GacSA等使细菌获得氨基糖苷类,替加环素,呋喃醌类,黏菌素,多黏菌素,黏菌蛋白等抗生素的抗药性。另一种途径是通过突变或拓扑多种包括青霉素结合蛋白(PBP)、DNA旋转酶fyrA、parC、16sRNA甲基化酶或二氢叶酸还原酶等异构酶使抗菌药物改变作用靶点并获得亚胺培南、氟喹啉、四环素、甲氧苄啶扽多种抗生素抗性。最后一种抗药性产生机制是限制抗生素进入目标部位,主要是通过上调包括RND、MATE、MFS、SMC家族在内的药物外排泵排除抗生素,使细菌获得氨基糖苷类、替吉西林、氟喹啉类、红霉素、氯霉素抗生素抗性;另一种情况是因为OmpA、CarO的丢失或Porin通道表达减少使细菌产生外膜渗透性缺陷并产生碳青霉烯类黏菌素,青霉素抗生素抗性。

2.2.1β-内酰胺酶抗性基因的定位 不动杆菌对β-内酰胺酶的耐药性部分是固有的,如铜绿假单胞菌中AmpC型头孢菌素酶赋予其β-内酰胺酶耐药性已经被证实。鲍曼不动杆菌通过频繁的基因水平转移使之高频率与外源DNA结合获得β-内酰胺酶的耐药性。β-内酰胺酶是在鲍曼不动杆菌中发现最多的一类耐药基因〔24〕。β-内酰胺酶的耐药基因检测大部分基于聚合酶链式反应(PCR)的靶向宏基因组学,通过追踪不同生态系统内部和系统之间的抗性基因或家族进行对应抗性基因引物的设计从而确定待测菌落包含相应基因的有无〔25〕。同样也可以使用实时PCR以获得半定量数据从而确定出不同生态系统中不同基因的相对丰度,部分的基因是通过微列阵技术检测〔26〕。

β-内酰胺酶主要分为4类,A类是经典β-内酰胺酶,包括抑制青霉素和窄谱头孢菌素的TEM和SHV家族,这其中也有部分成员拥有灭活广谱β-内酰胺酶的能力,如头孢噻肟酶(CTX)-M类被称为广谱β-内酰胺酶ESBLs。A类β-内酰胺酶也包括碳青霉烯酶如肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC),亚胺培南水解(IMI)型β-内酰胺酶和黏质沙雷菌酶(SME)等。除了少数KPC型酶外,A类碳青霉烯类主要被克拉维酸抑制,并可以更加有效地水解青霉素或头孢霉素〔27〕。在鲍曼不动杆菌中已发现多种包括TEM、SHV、圭亚那超广谱(GES)型β-内酰胺酶、CTX-M、SCO、假单胞菌扩展耐药性(PER)、越南超广谱(VEB)型β-内酰胺酶、KPC和羧青霉素水解(CARB)型β-内酰胺酶在内的多种A类β-内酰胺酶〔2〕。B类β-内酰胺酶是一种需要锌离子或其他金属离子催化的金属β-内酰胺酶,主要包含新德里金属β-内酰胺酶(NDM)、维罗纳整合素编码金属(VIM)型β-内酰胺酶和亚胺培南耐药假单胞菌(IMP)家族〔27〕。在鲍曼不动杆菌已鉴定出多种包括IMP、VIM、NDM家族和SIM-1在内的多种B类β-内酰胺酶〔2〕。C类β-内酰胺酶一般被称为头孢菌素(AmpC)酶,代表性的C类β-内酰胺酶包括头孢霉毒水解(CMY)型β-内酰胺酶,AmpC(ACT)型β-内酰胺酶和沙特阿拉伯达兰医院(DHA)型β-内酰胺酶。通常具有C类β-内酰胺酶的革兰氏阴性菌具有青霉素和部分头孢霉素的抗性,但不会对克拉维酸显著抑制〔27〕。在鲍曼不动杆菌中已经发现AmpC型β-内酰胺酶〔2〕。D类β-内酰胺酶包含苯唑西林酶(OXA)家族,其成员具有青霉素类,头孢菌素类和碳青霉烯类的抗性〔27〕。400多种OXA型酶已经在鲍曼不动杆菌中被鉴定。

2.2.2外排泵耐药基因的定位 在革兰阴性菌中,细胞外膜限制了抗菌剂进入细胞的速度,外排泵也会主动将多种结构不同的抗菌药物排出细胞外。外排泵在细菌致病性和多药耐药中被反复提及,外排泵排出的最常见的抗菌药物包含大环内酯类、四环素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、氯霉素、红霉素、替加环素等,鲍曼不动杆菌被证实对基于外排泵机制的抗菌药物如替加环素和亚胺培南具有耐药性〔28,29〕。

外排泵一般有6类:ATP结合盒(ABC)家族、耐药结节化因子(RND)超家族、主要促生因子(MFS)超家族、多药及毒性化合物外排转运蛋白(MATE)家族、药物/代谢产物转运蛋白(DMT)超家族和小多药耐药(SMR)家族转运蛋白〔30〕。与鲍曼不动杆菌耐药性相关的是RND超家族、MFS超家族、MATE家族和SMR家族转运蛋白〔2〕。基因定位手段类似于β-内酰胺酶类家族,通过靶向PCR或全基因组测序得知相应的抗性基因。

第一个被发现因为外排泵而产生耐药性的基因是AdeABC。拥有该基因的鲍曼不动杆菌首先被发现具有氨基糖苷类耐药性,而部分RND型外排泵被证明具有氨基糖苷类耐药性。后续通过靶向PCR证明了鲍曼不动杆菌中包含了adeB基因,随后通过基因测序发现3个相邻基因adeA、adeB和adeC的推断产物与构成RND型多药外派系统的蛋白质高度类似,因此推断鲍曼不动杆菌中包含AdeABC泵。通过RNA杂交发现AdeRS双组分系统严格调控AdeABC的表达,仅当AdeRS双组分系统功能缺失时导致AdeABC泵组成性表达,从而导致抗生素耐药性〔29〕。溴化乙锭是RND多药转运蛋白的有效且常见底物。使用溴化乙锭筛选鲍曼式杆菌的选定分离株,以确定是否存在外排泵〔31〕。由于RND系统在革兰阴性菌中普遍存在,因此不断有新的RND家族的成员被发现,后来有研究人员开发了一种居于寡核苷酸的DNA微阵列,用于评价鲍曼不动杆菌外排泵基因的表达,大大加速了外排泵相关研究的进程〔26〕。

在功能性宏基因组中,从待检测的细菌混合物中提取DNA并将其鸟枪克隆到合适的载体中以生成基因文库。通过对转入基因文库的大肠杆菌进行氯霉素筛选发现了TetA基因〔32〕。这种方法不同于以往的靶向PCR,该方法可以筛选出未知的抗性基因。其中AbeM的发现同样使用了类似的思路〔33〕。随后在2012年发明了一种新的高通量功能宏基因组的方法,这是一种大规模平行的,可同时进行多功能进行选择的平台,可以对数百个独立选择的抗性片段进行复制,被称为功能性宏基因组的平行注释和重组的筛选(PARFuMS)〔34〕。后续发现的外排泵耐药基因多是通过基于同源搜索或比较基因组学的方法对鲍曼不动杆菌中可能的外排泵进行搜寻或通过靶向PCR进行定位并寻找〔35〕。

2.2.3渗透性缺陷相关基因的定位 孔蛋白形成的通道对分子跨越外膜运输和毒力发挥起到重要作用。当一些孔蛋白表达减少时(CarO、Omp家族)导致鲍曼杆菌与碳青霉烯类抗生素(如亚胺培南,氨曲南,氯霉素和萘啶酸等)抗性增加〔36〕。研究发现,OmpA和CarO与OXA-23碳青霉烯酶发生物理相互作用,这种相互作用和抗生素耐药性相关〔37〕。除外膜蛋白外,LPS或肽聚糖缺失也会影响鲍曼不动杆菌抗药性,如LPS的缺失或修饰会降低鲍曼不动杆菌膜的完整性并增加大肠杆菌素抗性〔38〕。

2000年首次发现OmpA表达的减少与碳青霉烯的耐药性相关〔39〕。后续的多个Omp家族的蛋白都是通过质谱比较菌株之间的外膜蛋白的表达差异,测序和蛋白数据库等方法来确认相关基因〔40〕。一种典型的参与鲍曼不动杆菌亚胺培南和美罗培南耐药性的孔蛋白CarO的发现是通过对比两株菌株的OMP表达差异时发现亚胺培南的耐药性和29 kD的外膜蛋白的缺失相关。经过实验验证这29 kD的OMP缺失增加了与亚胺培南的抗性并通过实验定位到了CarO这个基因上,同时发现多种天然鲍曼不动杆菌的碳青霉烯耐药性是由于不同的插入元件破坏了CarO的完整性导致的〔41〕。

2.2.4氨基糖苷修饰酶相关基因的定位 氨基糖苷类修饰酶是鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗生素耐药的主要机制,酶是机制不通顺。氨基糖苷类修饰酶主要分为乙酰转移酶,腺苷转移酶和磷酸转移酶〔34〕。编码氨基糖苷修饰酶的基因可以位于质粒或转座子上,有研究发现在Ⅰ类整合子上也出现了氨基糖苷修饰酶,在鲍曼不动杆菌中已鉴定出了6种编译氨基糖苷修饰酶的基因,都是通过靶向PCR鉴定并得到的,其中磷酸纤维素纸可以用于鉴定氨基糖苷修饰酶的活性〔42〕。

2.2.5抗生素靶点的转变相关基因的定位 抗菌剂的靶点的重要特征是在微生物的生长生存中起到重要作用,因此会造成对应微生物破裂死亡或者抑制生长并且该靶点不应该存在于哺乳动物中或与哺乳动物中相应靶点充分不同〔5〕。例如作用于转肽酶或转糖酶的抗生素仅作用于微生物,而类似作用域蛋白质合成相互作用的药物,如氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类等;或作用于RNA聚合酶;如利福梅素;或作用于染色体分离(喹诺酮类)和完整性(甲硝唑);或作用于叶酸代谢如三聚体和嘧啶,其虽在哺乳动物中存在相应靶点,但差异性足以选择性抑制细菌的对应生理反应〔2〕。

因此,在长期抗生素的选择压力下,部分生物体相应的靶点发生突变并降低对应抗生素的敏感性并保证细胞的基本生理功能。最先被发现因为抗生素靶点转变导致的细菌耐药性是青霉素结合蛋白(PBPs)的改变。在检测不到β-内酰胺酶的情况下,鲍曼不动杆菌中改变后的低亲和力的PBPs过度表达增加了对亚胺培南的抗性,因而推测PBPs的改变增加了鲍曼不动杆菌对亚胺培南的抗性〔43〕。随后多个参与抗生素靶点改变的基因,如DNA旋转酶GyrA/ParC,二氢叶酸还原酶DHFR和FolA,脂多糖PmrC等都是通过靶向PCR或测序等手段定位到对应的关键耐药基因〔44〕。

综上,由于临床多药耐性鲍曼不动杆菌的流行,严重威胁重症监护室中危重患者和老年患者的生命健康,因此对鲍曼不动杆菌的研究刻不容缓,无论是临床还是科研对于鉴定菌株的耐药和相关基因都是必要的。鲍曼不动杆菌具有所有细菌耐药机制,并且所有的β-内酰胺酶在鲍曼不动杆菌都得到了检测。除此之外,几乎所有的鲍曼不动杆菌中都包含氨基糖苷修饰酶,众多外排泵介导的耐药也陆续地得到检测。现如今最有效的治疗手段依旧停留在黏杆菌素与其他抗生素联合治疗,鲍曼不动杆菌的致病机制已进行了广泛研究,多种毒力蛋白被发现,但其无穷无尽的获取抗生素的能力在世界范围内引起临床耐药株检出率越来越高,致死率也在不断升高。