诱导肝星状细胞铁死亡治疗肝纤维化的研究进展

孙立杰，郝丹丹

1.赤峰学院附属医院 普外科，内蒙古 赤峰 024005；2.赤峰学院 基础医学院 生理学教研室，内蒙古 赤峰 024000

肝纤维化(liver fibrosis)是一种由多种慢性肝损伤引起的异常创伤修复反应,其特征是弥漫性细胞外基质过度沉积和结缔组织异常增生,并可能进一步发展为肝硬化、肝衰竭或肝癌,缺乏有效的治疗方法[1]。因此,研究和开发抗纤维化药物仍然是当务之急。铁死亡(ferroptosis)是一种新发现的依赖于铁和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的调节性细胞死亡[2]。最近研究表明,铁死亡通过使肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)失活、抑制肝纤维化和诱导肝细胞死亡参与肝纤维化发病机制。 本文首先描述了铁死亡促进肝纤维化发展的具体机制,重点总结了可诱导HSC铁死亡的药物治疗肝纤维化的药理作用机制。本文提示靶向诱导HSC铁死亡是治疗肝纤维化的一种潜在的方法。

1 肝纤维化

肝纤维化导致细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白质(主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白)积聚,形成纤维瘢痕,取代受损的正常组织,最终损害正常肝功能[1]。受损的肝细胞还激活炎性反应细胞,如巨噬细胞和淋巴细胞,以产生多种细胞因子,包括转化生长因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)。这些细胞因子会导致ECM降解和合成的失调,导致肝纤维化的发展。如果损伤持续存在,且未及时采取治疗干预措施,肝实质将逐渐被过度ECM形成的瘢痕组织取代,导致肝脏标准结构丧失,并形成肝硬化,使肝细胞癌和胃肠道出血等严重并发症的风险增加。通常,两种类型的慢性肝损伤,即肝毒性损伤和胆汁淤积性损伤会导致肝纤维化[1]。肝毒性损伤是由外部因素引起的肝细胞慢性细胞损伤引发的,包括乙型肝炎和/或丙型肝炎病毒感染、酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪肝炎。原发性和/或继发性疾病,包括原发性胆管炎、原发性硬化性胆管炎和胆道闭锁,会阻碍或减少肝脏中的胆汁流量,从而导致胆汁淤积损伤[1]。肝纤维化具有共同的分子机制,涉及上皮或内皮屏障的破坏、肝细胞的损伤和死亡、慢性炎性反应和HSC的激活[3]。

2 铁死亡参与肝纤维化发病机制

铁死亡主要通过两种途径参与肝纤维化进程,即铁死亡可使HSC死亡失活进而抑制肝纤维化和诱导肝细胞死亡参与肝纤维化进程。

2.1 HSC铁死亡与肝纤维化

HSC激活是导致肝纤维化的核心事件,即HSC激活促进肝纤维化发生。而诱导HSC死亡从而使HSC失活对肝纤维化具有抑制作用。铁死亡的特异性调节因子诱导或抑制HSC铁死亡,其中ELAV样RNA结合蛋白1 (ELAV like RNA binding protein 1, ELAVL1)[4]、含溴多糖的蛋白7(bromodomain-containing protein 7, BRD7)[5]和三元基序蛋白26(tripartite motif-containing protein 26, TRIM26)[6]诱导HSC铁死亡,而ZFP36环指蛋白(ZFP36 ring finger protein, ZFP36)[7]抑制HSC铁死亡。ELAVL1是一种普遍存在的RNA结合蛋白,通过与BECN1/Beclin1 mRNA结合,促进自噬的激活,从而增强细胞凋亡。抑制自噬,完全破坏了ELAVL1介导的铁死亡;而诱导自噬,与ELAVL2有协同作用。在小鼠中,铁死亡诱导剂索拉非尼或伊拉斯汀(erastin)通过抑制泛素-蛋白酶体途径被上调ELAVL1的表达。上调的ELAVL1与BECN1 mRNA结合并促进BECN1/Beclin1的生成,导致铁蛋白的自噬依赖性降解和HSC的铁沉降,最终减轻肝纤维化。然而,HSC中ELAVL1的特异性敲除损害了索拉非尼诱导的小鼠肝纤维化中HSC的铁死亡[7]。BRD7直接结合p53,并促进p53线粒体易位,随后与溶质载体家族25成员28(solute carrier family 25 member 28, SLC25A28)形成复合物并提高SLC25A28活性,导致氧化还原活性铁过度沉积和HSC铁死亡发生。阻断BRD7与p53的结合能够抑制HSC中p53的线粒体易位和细胞凋亡。沉默SLC25A28能够抑制BRD7或p53介导的HSC铁死亡。铁死亡诱导剂伊拉斯汀通过诱导HSC铁死亡来改善小鼠肝纤维化。特异性阻断HSC的BRD7/P53/SLC25A28轴可以改善伊拉斯汀诱导的HSC铁死亡。总之,本研究表明BRD7/p53/SLC25A28轴参与诱导HSC铁死亡,靶向BRD7/p53/SLC25A28轴成为治疗肝纤维化的新靶点[5]。TRIM26是一种E3泛素连接酶,在CCl4诱导的小鼠模型纤维化肝组织中表达下调。TRIM26过表达抑制了HSC的增殖,促进了脂质过氧化,调控了铁死亡相关因子的表达,并抵消了铁抑制剂去铁胺的作用。此外,TRIM26与溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11, SLC7A11)相互作用,后者是清除脂质活性氧的关键蛋白,并介导其泛素化。此外,TRIM26过表达诱导小鼠HSC铁死亡,减轻CCl4诱导的肝纤维化。总之,TRIM26通过介导SLC7A11的泛素化促进HSC铁死亡以抑制肝纤维化。TRIM26靶向的SLC7A11抑制可能是一种新的肝纤维化治疗策略[6]。ZFP36是一种RNA结合蛋白,可以破坏ATG16L1(autophagy related 16 like 1) mRNA的稳定性,从而抑制自噬的激活,进而抑制铁死亡。铁死亡诱导剂索拉非尼通过激活泛素连接酶含F-框WD重复域蛋白7(F-box and WD repeat domain containing 7,FBXW7)下调ZFP36蛋白的表达。FBXW7过表达促进铁死亡发生,而 ZFP36过表达抑制FBXW7对HSC铁死亡的促进作用,同时ZFP36通过使ATG16L1 mRNA的稳定性降低进而抑制自噬的激活,ATG16L1过表达抵消ZFP36对铁死亡的抑制作用,而FBXW7过表达促进ATG16L1对自噬的激活作用,ZFP36促进ATG16L1的mRNA降解。因此,铁死亡诱导剂伊拉斯汀和索拉非尼治疗可以通过下调ZFP36、激活铁自噬和HSC铁死亡来改善肝纤维化[7]。在小鼠中,伊拉斯汀(erastin)和索拉非尼(sorafenib)通过诱导HSC铁沉积进而诱导铁死亡减轻肝纤维化,HSC特异性过表达ZFP36逆转了伊拉斯汀或索拉非尼诱导的HSC铁死亡,表明ZFP36是一种铁死亡抑制剂[7]。综上所述,铁死亡可使HSC失活,抑制肝纤维化。因此,通过药物促进HSC铁死亡,有望治疗肝纤维化。

2.2 肝细胞铁死亡与肝纤维化

目前,大多数研究聚焦HSC铁死亡与肝纤维化关系。近年来少量研究表明,肝细胞的铁死亡参与肝纤维化的发病机制,促进肝纤维化发生。铁过载是导致铁死亡的驱动因素,增加了肝纤维化和肝硬化的风险。铁过度累积,通过诱导血红素加氧酶1(heme oxygenase 1, HO-1)表达,增强肝细胞内的铁死亡,促进肝纤维化的进展;同时,伴随有体外和体内FGF21蛋白水平上调[8]。在铁死亡进程中,HO-1可能通过增强铁释放发挥促进死亡作用,从而参与铁死亡的发生[8]。因此,肝细胞铁死亡促进肝纤维化进展,而抑制肝细胞铁死亡能够达到治疗肝纤维化的目的。在2型糖尿病的db/db小鼠模型中,肝纤维化增加,表现为肝细胞中TGF-β、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原增加[9]。在肝细胞中发现铁死亡激活,表明ROS生成增加,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和谷胱甘肽(glutathione, GSH)活性下调,丙二醛(malondialdehyde, MDA)、4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal, 4-HNE) 和NADPH氧化酶4(NADPH oxidoreductase 4, NOX4)表达上调,转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TFR1)表达增加,铁转运蛋白1(ferroportin 1, FPN1)表达降低,SLC7A11和Nrf2/HO-1/GPX4信号通路下调[9]。同时,抗肥胖和糖尿病药物利拉鲁肽可以通过抑制铁死亡减轻肝纤维化[9]。这一结果提示,肝细胞铁死亡可能参与T2DM相关肝纤维化的发病机制。然而,肝细胞中的铁死亡在肝纤维化的发展和发病机制中的确切作用研究尚不深入,调节肝细胞铁死亡的深入分子机制仍需要进一步研究。

3 诱导肝星状细胞铁死亡与肝纤维化治疗

肝纤维化长期以来一直是全球关注的健康问题,目前还没有被食品药品监督管理局(FDA)批准的有效治疗药物。因此,探索基于新发病机制的治疗策略成为治疗肝纤维化的潜在突破口。近年来,通过药物诱导铁死亡清除激活的HSC治疗肝纤维化的研究逐渐引起关注。中药能通过多机制和多层面抑制肝纤维化的发展,是治疗肝纤维化疾病的重要手段之一。中药治疗肝纤维化具有多靶点、不良反应小、效果好等特点,引起学者关注。

3.1 抑制SLC7A11/GPX4轴诱导HSC铁死亡

目前研究表明,通过抑制SLC7A11/GPX4轴诱导HSC铁死亡的药物包括黄连素(berberine)[10]、前胡素(decursin)[11]、汉黄芩苷(wogonoside,WG)[12]、苦瓜提取物 (wild bitter melon extract, WBME)[13]、异甘草素(isoliquiritigenin)[14]、雷公藤红素(celastrol)[15]、大黄酚(chrysophanol)[16]和双氢青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)[17]。黄连素亦称小檗碱,是从中药黄连中分离的一种季铵生物碱,是一种潜在的抗肝纤维化药物,但其潜在机制尚不清楚[18]。最近研究显示,黄连素通过抑制SLC7A11/GPX4轴诱导HSC铁死亡, 从而抑制肝纤维化[10]。在硫代乙酰胺和四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型中,黄连素明显减轻小鼠肝纤维化,恢复小鼠肝功能,铁死亡抑制剂减弱黄连素的抗纤维作用,表明黄连素通过诱导铁死亡抑制肝纤维化[10]。前胡素是一种来自当归根的中药,是一种蛋白激酶C的激活剂,具有抗肿瘤活性,能够降低四氯化碳诱导的肝纤维化[11]。汉黄芩苷是从黄芩中分离得到的一种黄酮类苷化合物,具有抗炎作用。WG通过诱导HSC的铁死亡减轻肝纤维化[12]。苦瓜提取物具有促进脂多糖诱导的HSC激活和铁死亡,发挥抗肝纤维化作用[13]。 异甘草素是从光果甘草根中分到的黄酮类化合物,具有抗肿瘤的活性, 通过抑制GPX4表达并增加TFR和二价金属离子转运体(divalent metalion transperter,DMT1)表达,产生大量ROS,诱导HSC铁死亡,从而减轻肝纤维化[14],而膜内在蛋白微囊蛋白1(caveolin-1, Cav-1)通过促进HSC铁死亡发挥其抗肝纤维化作用,Cav-1介导的HSC铁死亡是异甘草素在体内外发挥抗纤维化作用所必需的[14]。雷公藤红素是具有多种生物活性的天然产物,来源于中药雷公藤的根皮,它是治疗类风湿病药物的有效成分之一,具有很强的抗氧化作用和抗癌症新生血管生成作用。最近研究发现,雷公藤红素通过促进诱导活化的HSC铁死亡发挥抗肝纤维化作用[15]。大黄酚又称为大黄根酸 (chrysophanic acid),来源于蓼科植物掌叶大黄的根和根茎,是一种天然蒽醌,是一种EGFR/mTOR通道抑制剂,对多种细菌有抗菌作用,能止咳、促进肠管运动、促使神经兴奋和肌肉麻痹,对小鼠黑色素瘤也有明显的抑制作用。大黄酚通过调节内质网应激和铁死亡减轻乙型肝炎病毒X蛋白诱导的肝星状细胞活化和肝纤维化[16]。双氢青蒿素为青蒿素的衍生物,对疟原虫红内期有强大且快速的杀灭作用,能迅速控制临床发作及症状。最近研究显示,DHA通过诱导活化HSC中的铁死亡缓解肝纤维化[17]。

3.2 促进铁蛋白自噬诱导HSC铁死亡

铁蛋白自噬(ferritinophagy)是一种核受体共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)介导的自噬过程,可以降解铁蛋白,将储存在铁蛋白中的铁释放到动态铁池中,并增加细胞中铁的可用性,从而促进脂质过氧化驱动的铁死亡。核受体共激活因子4(NCOA4)的上调可能在分子机制中发挥关键作用。NCOA4 siRNA可抑制DHA诱导的铁死亡,而NCOA4过表达可增强DHA对铁死亡的促进作用[17]。青蒿琥酯(artesunate)是青蒿素的水溶性半琥珀酸衍生物,具有抗肝纤维化作用[19-20],其以铁蛋白介导的方式显著促进活化HSC的铁死亡,发挥抗肝纤维化作用,其抗纤维化作用可被去铁胺(deferoxamine,DFO)完全消除[21]。

3.3 调控p53/SLC7A11通路诱导HSC铁死亡

蒿甲醚(artemether,ART)是青蒿素的另一种衍生物,能够通过激活p53进而抑制SLC7A11诱导HSC铁死亡,抑制HSC激活和改善肝纤维化[22]。在肝纤维化小鼠模型中,ART治疗显著减轻了肝损伤并减少了纤维化疤痕的形成。此外,体外实验还证实,ART治疗显著降低了HSC活化标志物的表达[22]。ART治疗的HSC表现出铁死亡的形态学特征,ART通过促进铁和脂质过氧化物的积累促进铁死亡发生,而铁死亡抑制剂铁抑素-1(ferrostatin-1,Fer-1)抑制铁死亡后完全消除了ART诱导的抗纤维化作用。而肿瘤抑制因子p53是促进ART诱导的HSC铁死亡的上游分子,敲低p53明显阻断ART诱导的HSC铁死亡,进而加剧肝纤维化[22]。表明ART调控p53/SLC7A11通路诱导HSC铁死亡。

3.4 激活ACSL4通路诱导HSC铁死亡

酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(family member 4 acyl-CoA synthetase long-chain,ACSL4)是多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)代谢中的重要同工酶,其激活促进铁死亡发生。DHA通过激活ACSL4诱导活化HSC中的铁死亡缓解肝纤维化[17]。DHA上调原代培养HSC中ACSL4的mRNA表达,诱导HSC活化中和铁死亡发生,而铁死亡抑制剂Fer-1和 利普司他丁-1(liproxstatin-1)能够逆转DHA对HSC铁死亡的促进作用[17]。表明DHA通过激活ACSL4诱导HSC铁死亡,进而缓解肝纤维化发生。

3.5 其他机制

N6甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰可能通过稳定BECN1 mRNA激活自噬增强HSC铁死亡[23]。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA) 抑制自噬后减弱DHA诱导的HSC铁死亡。DHA通过抑制脂肪质量和肥胖相关基因 (fat mass and obesity-associated gene,FTO)进而促进 BECN1 mRNA的m6A修饰,进而稳定 BECN1 mRNA从而激活自噬,从而诱导铁死亡发生[24]。在小鼠中,DHA治疗通过触发HSC铁死亡减轻肝纤维化。HSC特异性抑制m6A修饰和自噬可损害DHA诱导的小鼠肝纤维化HSC铁死亡,为揭示DHA诱导的铁死亡的分子机制提供了新的含义,指出m6A修饰依赖性铁死亡是治疗肝纤维化的潜在靶点[24]。

4 问题和展望

铁死亡参与肝纤维化发病机制,探索靶向抑制铁死亡治疗肝纤维化是一个方兴未艾的领域。研究报道,活性小分子化合物能够通过靶向诱导HSC铁死亡从而达到治疗肝纤维化的作用。但这一领域尚有很多未解课题。首先,目前相对研究透彻的是HSC铁死亡在肝纤维化进程中的作用,而对肝细胞铁死亡、肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell)和炎性细胞(如中性粒细胞、枯否细胞、骨髓源单核细胞和Th17细胞)的铁死亡在肝纤维化进程中的作用鲜有涉足,迫切需要揭示肝纤维化进程中肝细胞铁凋亡的调控机制。其次,铁死亡可能在不同的细胞类型中发挥完全相反的作用,诱导HSC中的铁死亡作为肝纤维化的治疗手段,而同时诱导肝细胞中的铁死亡可能会加重肝纤维化。因此,靶向铁死亡治疗肝纤维化过程中可能起到双刃剑的作用,并可能有不良反应,需要谨慎进行。通过靶向特定细胞类型的药物输送系统可能很大程度的缓解。尽管目前实验研究表明,铁死亡参与了肝纤维化的病理机制,通过药理学手段可以靶向干预铁死亡,但其详细机制还有待进一步深度挖掘,其广阔的应用前景也有待进一步开拓。总之,铁死亡在肝纤维化发病进展中具有非常重要的地位,而靶向诱导HSC铁死亡是治疗肝纤维化新的有希望的靶点,是一种潜在的治疗方法,探索其他药物通过调控铁死亡治疗肝纤维化具有广阔应用前景,也值得进一步研究。