基于网络药理学和实验验证探究糖肾宝复方治疗糖尿病肾病的作用机制

苏芳林，罗鑫，唐赛男，黄乐韵，胡维，陆世龙，冉龙娇，向少伟

1.广西中医药大学研究生院，南宁 530200；2.广西中医药大学附属瑞康医院肾内科，南宁 530011；3.广西中西医结合肾脏疾病临床医学研究中心，南宁 530011

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）常见的慢性并发症之一，也是终末期肾病的主要病因，其发病机制复杂，演变过程主要以肾小球基底膜增厚、基质扩张、内皮细胞功能受损等为主要症状，最后继发为肾小球硬化症、肾小管间质纤维化等。近年来，中医药治疗DN 疗效显著，但其具体干预机制仍需多方位探究。

糖肾宝复方（TSB）由黄芪、川芎、三七、葛根和大火草制成，在临床上已广泛应用于DN 的治疗。本课题组前期研究［1-3］发现高糖诱导下肾脏组织过表达的E26 转录因子-1（E26 transformationspecific，Ets-1）可致肾小球内皮细胞（Fli-1）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecules-1，ICAM-1）表达升高，内皮细胞迁移率、功能下降明显，并诱导细胞外基质Ⅳ型胶原（ColⅣ）、纤黏蛋白（fibronectin，FN）积聚，促进肾损害发生。

近年来，网络药理学作为中医药研究领域的一种新型工具，弥补了传统中药研发中对药物靶标治疗策略研究的缺陷，开启了多成分-多靶标的新型研究模式［4］。因此，本研究通过网络药理学结合分子对接及体外细胞验证手段预测并验证TSB 治疗DN 的作用机制，以期为后续深入研究糖肾宝复方防治DN 的确切分子机制提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与动物 小鼠肾小球系膜细胞株（SV40-MES-13，货号：CL-0470，STR 鉴定合格，武汉普诺赛生命科技有限公司）。24 只健康雄性SPF级KM小鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司），生产许可证号〔SCXK（湘）2019-0004〕。本研究经广西中医药大学伦理委员会批准（DW20221229-304）。

1.1.2 仪器 荧光定量PCR 仪（Roche Light Cycler480 美国）；涡旋混合振荡器（Scientific Industries Thermo）；全波长酶标仪（德国Thermo Fisher公司）；倒置显微镜（日本Olympus）；二氧化碳培养箱（德国美墨尔特）；ST 16R 型高速冷冻离心机（德国Thermo Fisher公司）。

1.1.3 试剂 DMEM 高糖培养基（Gibco 美国），胎牛血清（FBS，Gibco 美国），引物（上海生工生物科技有限公司），CCK-8 试剂盒（MCE 公司），总RNA 制备试剂盒（莫纳生物科技有限公司），cDNA 合成试剂盒（莫纳生物科技有限公司），SYBR Green qPCR Mix 试剂盒（莫纳生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 网络药理学组方药物活性成分及靶点筛选 通过中药系统药理学数据库及分析平台（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php，TCMSP），对TSB 复方药材活性成分进行检索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（druglikeness，DL）≥0.18 为筛选条件，经知网检索相关文献收集补充组方药味关联性化合物［5-14］，最后结合Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）数据库得到组方活性成分相关靶点。

1.2.2 TSB-DN 疾病交集靶点分析 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/home/）、OMIM（https：//omim.org/）等数据库中以“Diabetic nephropathy”为关键词检索，搜集DN 相关靶蛋白并通过生物信息学和进化基因组学（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）在线作图软件得到“TSB-DN”共同作用靶点及其Venn图。

1.2.3 PPI 网络构建与分析 TSB 治疗糖尿病肾病（DN）的交集作用靶点导入STRING 数据库中，物种限定“Homo sapiens”设置置信度值大于0.9，结合Cytoscape 3.7.2 软件进行Cyto NCA 网络拓扑分析以Degree＞中位数值为条件筛选2 次，并进行结果可视化分析。

1.2.4 交集靶点GO、KEGG 富集分析 将“PPI”分析筛选得到的靶蛋白导入DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），进行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，以“P＜0.05”作为标准进行筛选，取前10 数据导入微生信数据可视化平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）中进行结果可视化分析。

1.2.5 “中药-成分-靶点-通路”网络图构建 将TSB 复方药物、活性成分、筛选后的靶点、及通路和相关靶点关联数据导入Cytoscape 3.7.2软件中，构建得到“中药-成分-靶点-通路”网络图并通过Network Analasisi进行分析。

1.2.6 分子对接 从Pubchem 数据库中下载经“中药-成分-靶点-通路网络图”分析得到的核心活性成分2D 结构文件，作为对接配体分子，再通过PBD 数据库下载得到筛选后的核心靶蛋白文件，作为对接蛋白。蛋白与配体分别使用PyMOL 和AutoDock Tools 软件进行氢化、去除水分子、能量最小化处理，并用AutoDock Vina 软件来完成核心活性成分配体与核心靶蛋白晶体结构的对接，经PyMOL完成最后的对接结果可视化处理。

1.2.7 体外细胞实验的药物制备、动物分组与含药血清制备 依据前期研究［1-3］，组方分次加蒸馏水1 000 mL 和500 mL，煮沸2 h 和1.5 h，合并药液，过滤、浓缩至含生药2.0 g·mL-1，高压灭菌后置于4 ℃冰箱封存待用。

24 只KM 小鼠适应性饲养7 d 后，随机区组法分为正常组、糖肾宝低剂量组、糖肾宝高剂量组，每组8 只。分别予以正常组蒸馏水0.3 mL，糖肾宝合剂（按生药含量计算）11.375 g·kg-1·d-1、22.75 g·kg-1·d-1（蒸馏水稀释至 0.3 mL）灌胃，连续7 d。末次灌胃2 h 后眼球取血，3 000 r·min-1离心30 min，血清56 ℃水浴30min 灭活补体，0.22 μm 无菌滤器过滤除菌，即得各组含药血清。

1.2.8 小鼠肾小球系膜细胞培养与分组干预SV40-MES-13细胞常规培养于含10%的胎牛血清培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。实验分为4 组：正常对照组（5.5 mmol·L-1葡萄糖+正常组含药血清）、高糖组（25 mmol·L-1葡萄糖+正常组含药血清）、糖肾宝低剂量组（25 mmol·L-1葡萄糖+糖肾宝低剂量组含药血清）、糖肾宝高剂量组（25 mmol·L-1葡萄糖+糖肾宝高剂量组含药血清）。

1.2.9 CCK-8法检测细胞活性 取处于对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，调节细胞浓度，使得细胞以2.5×104·mL-1的密度接种于96 孔培养板，当细胞贴壁后，按实验分组，于对应孔中加入对应组别的葡萄糖溶液及含药血清进行干预，每个实验组设置6 个复孔，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h 后加入CCK-8 显色。在酶标仪上读取各孔OD450吸光值。

1.2.10 qPCR检测靶基因mRNA表达 取处于对数生长期的细胞接种于6孔板中，各组用相应糖肾宝含药血清进行药物干预处理，24 h后弃上清，用Monzol Reagent Pro 法提取细胞总RNA，采用Mon-Script试剂盒将RNA反转录合成cDNA。实时定量PCR 反应体系按MonAmp SYBR Green qPCR Mix试剂盒说明书进行配置。以GADPH为内参，采用公式2－△△Ct计算目的基因的相对表达量，各引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2.11 统计学方法 用SPSS 25.0 统计软件进行数据分析。计量资料采用（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 网络药理学分析

2.1.1 TSB 活性成分及靶点筛选结果 通过TCMSP数据库筛选和查阅文献补充，TSB复方6味中药材共含有化学成分102个，其中黄芪33个、川芎26 个、三七20 个、葛根22 个、大火草1 个。Swiss Target Prediction 数据库预测、搜集、合并去重后共获得TSB 作用靶点835 个，根据OB 值排序，主要活性成分基本信息见表2。

表2 TSB组方药物主要活性成分信息Table 2 Information of main active ingredients of TSB prescription drugs

2.1.2 TSB-DN 交集靶点结果 GeneCards、Dis-GeNET、OMIM 数据库分别筛选得到“Diabetic nephropathy”疾病相关靶点2 901、1 058、511 个，通过合并、删除重复靶基因后共获得3 584个疾病基因，取TSB 相关药物靶点构建“TSB-DN Venn 图”后共获得443个“TSB-DN ”交集靶点（图1）。

图1 TSB组方与糖尿病肾病交集Venn图Fig.1 Venn diagram of intersection of TSB prescription and diabetic nephropathy

2.1.3 PPI 网络分析结果 将443 个“TSB-DN”交集靶点导入STRING 数据库中，物种限定“Homo sapiens”，Score 得分≥0.9，筛选得到蛋白互作关系“TSV”数据，结合Cytoscape 3.7.2 软件，进行Cyto NCA 网络拓扑分析，绘制得到TSB 复方治疗DN 的相关靶点互作网络图，包含340 个节点，339 条边，通过Degree＞中位数，筛选两次后共得到86 个关键靶点，筛选后的节点用红色表示（图2），其中Degree 最高的10 靶点分别为SRC、PIK3R1、STAT3、PIK3CA、HSP90AA1、PIK3CB、AKT1、PIK3CD、GRB2、EGFR，它们可能是TSB复方治疗DN 的核心靶点，结果表明这些蛋白可能在治疗DN 过程中具有重要的调节作用。

图2 “TSB-DN”交集靶点PPI网络图Fig.2 PPI network diagram of "TSB-DN" intersection target

2.1.4 GO、KEGG 富集分析结果 将86个关键靶点导入DAVID 数据库后进行GO 功能富集，得到742条具有显著意义的条目（P＜0.05），取前10条目可视化结果（图3）。TSB复方治疗DN可能与蛋白磷酸化（protein phosphorylation）、蛋白磷酸正调节（positive regulation of protein phosphorylation）、细胞信号转导（intracellular signal transduction）、基因表达正调控（positive regulation of gene expression）、胰岛素生长因子信号通路（insulin-like growth factor receptor signaling pathway）、细胞质等离子膜非固有成分（extrinsic component of cytoplasmic side of plasma membrane）、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性（proteins erine/threonine/tyrosine kinase activity）、ATP结合（ATP binding）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）等功能相关。

KEGG 通路富集，得到126 条通路（P＜0.05），取前10 条通路进行可视化（图4）。对前20 条通路结果进行分析发现，主要涉及疾病（乙型肝炎、前列腺癌、脂质和动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染）和信号通路（PI3K-Akt、AGERAGE、FoxO、ErbB、PD-L1/PD-1 等），其中PI3KAkt、AGE-RAGE、FoxO、ErbB 等可能是TSB 治疗DN 发挥主要作用的信号通路，以上结果表明，组方TSB 治疗DN 主要是通过多层次生物学过程联合不同信号通路发挥作用。

2.1.5 “中药-成分-靶点-通路”网络图分析 将TSB 复方治疗DN 的86 个关键靶点GO、KEGG 富集分析后得到的前20 条通路，与TSB 复方药物、药物成分、关键靶点、通路靶点关联数据文件，导入Cytoscape 3.7.2 软件中，构建得到“中药-成分-靶点-通路”网络图（图5），包含205 个节点，2 066条边，Network Analasisi 网络拓扑分析结果表明，依照Degree 排序，TSB 治疗DN 的核心活性成分主要为异微凸剑叶莎醇（isomucronulatol）、3，9-di-O-methylnissolin、20（S）-原人参三醇［（20S）-protopanaxatriol）］、香豆雌酚（coumestrol）、甘草素（Liquiritigeni）、华良姜素（jaranol）等。核心靶点主要为 STAT3、CDK1、EGFR、PIK3CD、MAPK8、HSP90AA1、PIK3R1、AR、PIK3CA、PTGS2。该核心靶点与PPI 筛选得到的前10 核心靶点取交集，确定TSB 治疗DN 的主要核心靶点为STAT3、EGFR、PIK3CD、HSP90AA1、PIK3R1、PIK3CA 等，表明其治疗DN 发挥主要作用的信号通路为PI3KAkt、AGE-RAGE、FoxO、ErbB等。

2.1.6 对接结果可视化 Pubchem 数据库下载得到核心活性成分结构文件，PBD 数据库下载得到核心靶蛋白文件，AutoDock Vina 软件完成核心活性成分与核心靶蛋白分子对接。结果（表3）显示，isomucronulatol、3，9-di-O-methylnissolin、（20S）-protopanaxatriol、coumestrol、Liquiritigeni、jaranol 等与核心靶点STAT3、PIK3CD、PIK3R1、PIK3CA 及关联性靶点ETS-1 等具有较高结合作用（结合能＜-7.9 kcal·mol-1）。其中Liquiritigeni、（20S）-protopanaxatriol 与各靶点结合能相对较优，暗示这二者在TSB 治疗DN 的过程中起到重要作用，通过PyMOL 对其部分结果进行可视化，结果见图6。由图6 结果可知，甘草素与20(S)-原人参三醇能够与各靶蛋白结构实现良好结合从而发挥中药复方多成分、多靶点相互作用的治疗效果。

图6 分子对接可视化结果Fig.6 Molecular docking visualization results

表3 核心活性成分与核心靶点分子对接结果Table 3 Results of docking between core active ingredients and core target molecules

2.2 体外细胞实验验证

2.2.1 SV40-MES-13 细胞培养与干预 镜下可见（图7），SV40-MES-13 细胞干预前，生长良好，细胞形态呈梭形或类圆形未分化状，细胞透光性良好，胞质清晰，胞距紧凑。干预24 h 后可见细胞形态发生改变呈梭形凸起及类圆形凸起状，胞质凸起暗淡，边界模糊，透光性较差，干预前后细胞状态差异显著表明含药血清干预的有效性。

图7 SV40-MES-13细胞含药血清干预前后状态Fig.7 State of SV40-MES-13 cells before and after treatment with drug-containing serum

2.2.2 SV40-MES-13 细胞活性比较 实验结果显示（图8），SV40-MES-13 细胞在高糖环境下干预24 h后，与正常组相比，高剂量组细胞活性显著降低（P＜0.001）。高糖组及低剂量组与正常组无统计学差异，与高糖组相比，高剂量与低剂量组细胞活性均具有显著性差异（P＜0.001，P＜0.01）。结果表明，SV40-MES-13 细胞经高糖刺激后细胞活性相较于给药组有所增加，这提示TSB 在作用于细胞后或起到抑制、镇静作用。

图8 TSB对SV40-MES-13细胞活性影响Fig.8 Effect of TSB on SV40-MES-13 cell activity

2.2.3 相关信号通路靶基因mRNA表达比较 实验结果显示（图9），与正常组比较，高糖组SV40-MES-13 细胞中PIK3CD、PIK3R1、ETS-1mRNA 表达量显著升高，高剂量组细胞中PIK3CD、PIK3R1、MAPK8、STAT3mRNA 表达量显著降低；与正常组比较，低剂量PIK3CD、STAT3mRNA表达量显著降低；与高糖组比较，高剂量、低剂量组细胞中PIK3CD、PIK3R1、STAT3、ETS-1mRNA 表达量显著降低。结果表明，TSB 复方可能通过抑制PIK3CD、PIK3R1、MAPK8、STAT3、ETS-1等基因的表达实现调控PI3K-Akt、AGE-RAGE信号通路，进而使得细胞活性在一定程度上降低并发挥对DN的治疗作用。与高糖组比较，高剂量组中MAPK8mRNA 表达量显著降低，而低剂量组中MAPK8mRNA 表达量显著升高，推测可能是由于低剂量组血清药物浓度有所不足导致干预后细胞基因抑制度不足。

图9 TSB治疗DN相关信号通路靶基因结果Fig.9 Target gene results of DN-related signaling pathway treated by TSB

3 讨论

DN 作为DM 最常见的慢性并发症之一，由于病因和致病机理复杂及严重的糖代谢紊乱，发展到终末期肾病比其他肾脏疾病的治疗更加棘手［15］。当前传统的西医治疗方法往往伴随着严重的不良反应，对患者的病情会产生负面影响。中西医结合技术因其更好的预防性能够更快速、更安全地改善患者病情而成为当前的最佳选择［16］。

DN在中医中无对应病名，其中医病机我国医学各流派见解各异，如柳红芳［17］认为，DN 病机主要是精损络痹，核心治法为填精通络，如《内经·五变篇》中提出五脏虚弱，正气不足容易患消瘅［18］。本课题组［15］认为糖尿病的中医病机以“气虚血瘀证”为基本，糖肾宝组方（TSB）以黄芪为君，补气升阳；川芎三七葛根共为臣行气活血化瘀通络；以大火草为佐清热利湿。五药共用，攻补兼施，益气活血。在课题组的前期实验研究和临床上均体现出明显效果［19-23］。然而，糖肾宝复方治疗DN 的其他有效活性成分和作用机制目前尚未得知。

基于此，本研究通过网络药理学研究方法，构建复方糖肾宝治疗DN 的“中药-成分-靶点-通路”网络图，推测TSB 治疗DN 可能是通过PIK3R1、STAT3、PIK3CD 等靶基因发挥作用。KEGG 通路富集结果显示，PI3K-Akt、AGE-RAGE、FoxO、ErbB等信号通路可能是复方糖肾宝治疗DN 的重要机制，与上述核心靶点存在一定的联系。相关靶基因中PIK3CD 是磷酸肌醇-3 激酶（PI3kinase，PI3K）的一个调节亚基，是PI3K-AKT 信号通路的重要组成部分，在细胞增殖、迁移和癌症进展中发挥着重要作用［24］，磷脂酞肌醇-3 激酶调节亚基1（PIK3R1）是PI3K 的调节亚基之一，主要参与对PI3K/Akt 信号通路的调节。相关研究表明［25］，PIK3R1 通过PI3K/AKT 信号通路缓解肺内皮细胞损伤从而起到调控PI3K/Akt 信号通路的激活与炎症、细胞凋亡反应［26-28］。而STAT3 是信号转导与转录调控因子之一，具有传递信号的作用，在宫颈癌的进展中，宫颈上皮细胞的失衡与STAT3 激活具有直接关系［29］。

此外，糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）及其受体RAGE 介导的内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是引发DN 的经典通路之一。大量研究显示，长期的高糖环境容易导致肾脏AGEs/RAGE的生成增多，从而引起肾脏组织ERS 激活，启动PERK 信号通路，导致患者肾组织细胞凋亡，继而出现肾功能显著损伤［30-32］。

本研究采用分子对接法、cck8 法、以及qRTPCR 法检测DN 相关疾病通路基因进行实验验证，结果显示TSB 组方可通过抑制PIK3R1、PIK3CD 和MAPK8、STAT3、ETS-1 等靶基因的mRNA 表达，实现对PI3K-Akt、AGE-RAGE 等信号通路进行调控并发挥对DN的治疗作用。

综上，本研究通过网络药理学方法和体外细胞实验验证揭示了糖肾宝复方治疗DN 的潜在作用机制，一定程度上证明了糖肾宝复方能够通过多靶点、多通路治疗DN。为临床应用此方治疗DN提供一定的理论基础和技术支持，然而本研究中预测的其他相关靶蛋白量的表达及代谢组学层面表达仍具有进一步检测验证价值，后续会尽可能完善糖肾宝复方治疗DN的多方面研究。