铜绿假单胞菌适配体的获得及应用

刘星雨 李洁 朱龙佼 李相阳 许文涛

（1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2. 北京农学院食品科学与工程学院, 北京 102206；3. 中国农业大学营养与健康系，北京 100083）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种适应性和多样性极高的微生物，能够定植广泛的生态位，是引起人类机会性感染最主要的条件致病菌［1-2］。铜绿假单胞菌是囊性纤维化、慢性阻塞性肺病、支气管扩张等基础呼吸道病患病情加速加重的主要因素，可引起术后创口感染、烧伤创面感染，菌体通过血液散播并产生毒素，引发菌血症、败血症而造成死亡，目前已经成为重症监护病房感染的第二大致死病原菌［3-5］。铜绿假单胞菌的致病性主要是由于其大量的毒力因子和抗生素耐药性造成的，其毒力因子主要包括脂多糖、外膜蛋白、多种分泌物等。作为常见的致病菌，铜绿假单胞菌即使是在低浓度下也会引起严重的感染，其生物膜的形成和外膜的低渗透性，使其对抗生素和抗菌剂具有良好的抗性［6］。作为一种具有强抗药性的条件致病菌，铜绿假单胞菌在2017年被列为世界卫生组织抗药性细菌名单中的第二大威胁，并进入高优先级病原体名单，而感染的患者本身抵抗力低下，用药情况复杂，使得抗菌药物的选择更加局限，一旦感染，临床治疗十分困难。鉴于其严重的危害，针对铜绿假单胞菌的疫苗已经进行了50多年的研究，但仍然缺少可用的产品［7］。因此早期检测诊断在铜绿假单胞的防治中十分重要，这就需要快速、高效、高特异性地对其进行检测，并且持续不断的对其感染后的治疗进行研究。适配体作为一种新型的靶向识别元件，在铜绿假单胞菌的检测和防治方面得到了许多研究者的关注。

适配体是通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）得到的具有特异性识别能力的人工合成寡核苷酸序列，1990年首次通过体外筛选被开发［8］。适配体一般为几十个碱基构成的DNA或者RNA序列，目前已经有超过千项的适配体筛选研究被报道［9］。适配体的可识别靶标十分丰富，包括重金属、细胞、蛋白质等多种物质［10］。由于其具有高亲和力、高特异性且易于合成和修饰等特点，得到了广泛的研究。

本文总结了目前铜绿假单胞菌适配体的筛选和裁剪，并从铜绿假单胞菌的检测和防治两个方面对其适配体的应用进行了介绍，以期为铜绿假单胞菌适配体的开发和应用提供参考。

1 铜绿假单胞菌的筛选和裁剪

高性能适配体的获得是实现多领域应用的基础，为了获得更好的适配体，往往需要进行筛选和裁剪。在适配体的筛选中，首先对寡核苷酸文库进行制备，并将含有随机寡核苷酸数量超过1014以上的RNA或者DNA文库与靶标物质进行孵育，经过一定时间的反应后，将可以与靶标结合的核酸序列与未结合的核酸序列进行分离，对于可结合靶标的核酸，通过PCR等方式对其进行扩增，以生成新的寡核苷酸库。重复以上步骤5-15次后对富集文库进行测序，并通过多种技术对测序得到的序列进行亲和力和特异性分析，最终从数量庞大的文库中得到具有优越性能的适配体序列用于下一步的传感器开发（图1）［11-13］。尽管通过几轮甚至十几轮的筛选，可以从中获得较好的核酸序列，但是由于随机文库筛选中固有的局限性，即使随机文库中已经具有相当多数量的核酸序列，筛选获得适配体序列依然可能存在部分碱基在特异性的识别中不能发挥积极的作用，因此通过裁剪对这些冗余的碱基进行去除或对有效碱基进行重复有助于获得性能更优的适配体。目前，针对铜绿假单胞菌已有多种适配体得到了开发和应用，除了以微生物适配体筛选中常见的全细胞作为筛选靶标外，铜绿假单胞菌的外毒素A和脂多糖也被用作靶标进行相关适配体的筛选（表1），多种铜绿假单胞菌靶标适配体的筛选为其检测提供了更加广泛的可能性。此外，在已经筛选的铜绿假单胞菌适配体中，既包括DNA适配体，也包括RNA适配体。

表1 铜绿假单胞菌适配体的筛选Table 1 SELEX of Pseudomonas aeruginosa aptamers

图1 SELEX 流程图Fig. 1 Flowchart diagram of SELEX

全菌是微生物适配体筛选中最常见的靶标，利用菌体较大的特点，通过离心操作可以有效的分离结合序列和未结合序列，在铜绿假单胞菌的适配体筛选中，既包括了以死菌为靶标的适配体筛选，也包括了以活菌作为靶标的筛选。2011年，Wang等［14］首次对铜绿假单胞菌的适配体进行了筛选，经过15轮的筛选，文库通过流式细胞术测定的结合能力不再继续增加，因此结束筛选进行核酸测序，经过测序得到了亲和力为（17.27 ± 5.00）nmol/L的适配体序列。2017年，Soundy等［15］首次针对活的铜绿假单胞菌开展了适配体的筛选。经过7轮的全细胞筛选，对荧光标记的适配体进行流式细胞术分析，第7轮文库与靶标的结合效果与初始文库相比有了显著的增强，经过测序得到了适配体序列JN08和JN27，经过二级结构预测，JN27中单个茎环为唯一显著的稳定结构。因此对该茎环部分单独进行序列合成，并通过流式细胞术进行结合效果的评估，结果验证具有茎环结构的适配体序列具有较好的结合效果，是筛选得到的长适配体序列的核心结合区域。

除了对全菌进行筛选，铜绿假单胞菌的毒力因子也已经作为靶标物质开展了适配体的筛选。外毒素A是铜绿假单胞菌重要的毒力因子，也是其感染的重要标志物。Hong等［16］利用诱饵SELEX（Decoy-SELEX）对外毒素A的适配体进行筛选。在筛选中牛血清白蛋白和霍乱毒素作为负筛靶标使用，经过14轮的筛选对测序得到的适配体序列，利用表面等离子共振进行亲和力的检测，得到Kd值为4.2-4.5 μmol/L。此外，Ye等［17］基于Capture-SELEX技术筛选得到了适用于包括铜绿假单胞菌在内的多种菌脂多糖检测的适配体，其长度为80 nt，由于较长的核酸序列难以从石墨烯表面进行释放，进一步对其进行裁剪，并利用等温量热滴定法对其亲和力进行评估，最终确定了27 nt的最佳适配体，该适配体可以对鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌的脂多糖进行识别和结合，并且在裁剪中亲和力从（102±17）nmol/L上升至（46.2±9.5）nmol/L。

除了这些DNA适配体，铜绿假单胞菌的RNA适配体也得到了开发。与DNA适配体相比，RNA适配体尽管稳定性稍差但在内化至细胞方面更具优势。利用氟修饰的RNA文库，Davydova等［18］筛选得到了可以内化到细菌细胞中的适配体，测序后发现，该适配体与铜绿假单胞菌rRNA片段相同，进一步佐证了该适配体可以内化至细菌细胞的可能性。

2 铜绿假单胞菌适配体的应用

作为一种具有严重危害的安全风险因子，如何进行快速检测和防治十分关键。经过筛选和裁剪得到的适配体作为一种高亲和力、高特异性的识别元件可以在检测和治疗上进行应用。目前基于适配体的铜绿假单胞菌检测及其引起的疾病治疗，引起了研究者的广泛关注。

2.1 适配体在铜绿假单胞菌检测中的应用

作为一种亟待检测的致病微生物，许多用于铜绿假单胞菌检测的方法已经得到了开发，包括传统检测中常见的微生物分离培养与鉴定，以聚合酶链式反应为主的分子生物学方法和以酶联免疫分析为主的免疫学技术［22-23］。尽管已有的检测方法十分多样，但是这些方法往往受到成本、检测时间和检测性能不佳的制约。因此，适配体因其独特的优势得到了研究者的青睐。

由于可以直接地肉眼对检测结果进行观察，且检测简单快速，因此比色法是常见的生物传感器。如图2-A所示，Schmitz等［24］基于带负电荷的核酸可以非特异性地与金纳米颗粒进行结合，并因此阻碍其聚集变色的原理，开发了一种无需对纳米颗粒进行表面改性的适配体生物传感器，用于铜绿假单胞菌的检测。这种比色的检测方法简单快速，但由于缺少信号放大和更灵敏的信号读取，检测限往往不足以满足检测的需求。因此，基于适配体和纳米酶的电化学方法应运而生。电化学传感器是以工作电极作为固定生物识别分子和电化学活性分子的平台，靶标导致电极表面发生化学反应，而后被转换为安培、阻抗等不同形式的电化学信号。同样是基于核酸适配体对金纳米颗粒的非特异性吸附，Das等［25］利用金纳米颗粒固有的过氧化物酶活性，开发了一种超灵敏的电化学适配体传感器，金纳米颗粒催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethyl benzidine, TMB），可以产生具有电活性的产物二亚胺，进一步转化为电信号输出，该传感器可以在10 min内完成对铜绿假单胞菌的检测，检测限约为10 CFU/mL（图2-B）。相似地，Abedi等［26］开发了一种夹心型的电化学适配体传感器，利用双信号放大的策略实现了铜绿假单胞菌的高灵敏检测。如图2-C所示，适配体分别固定在具有银纳米粒子的二维石墨氮化碳和经过修饰的碳丝网印刷电极上，当铜绿假单胞菌存在时电极上的适配体对其进行捕获，随后加入具有银纳米粒子的二维石墨氮化碳，其上的适配体同样与铜绿假单胞菌进行结合，从而形成三明治夹心结构，银纳米粒子作为一种报告信号实现电信号的增强，该传感器可以实现1 CFU/mL的检测限，并且可以实现活死菌的区分。Roushani等［27］以六氰亚铁酸盐为电化学指示剂，搭建银纳米粒子-玻碳电极传感器，对血清样本中的铜绿假单胞菌进行了检测，检测限为33 CFU/mL。

图2 用于铜绿假单胞菌检测的适配体传感器Fig. 2 Aptamer sensor for P. aeruginosa detection

除了比色法和电化学方法，荧光生物传感器也常见于各种微生物检测中。适配体荧光传感器是通过荧光信号标记的适配体与靶物质相互作用，引发荧光强度变化或偏振来实现检测，适配体荧光传感器具有操作快速、成本低、仪器简单等优势，是一种常用的检测方案。Xie等［28］认为杂交链式反应和DNA酶的联合使用有助于更低检测限的实现，因此开发了一种基于双链DNA分支迁移诱导的HCR和DNA酶反馈电路的荧光生物传感器，用于铜绿假单胞菌的灵敏检测。如图2-D所示，当靶标存在时，双链DNA分支迁移产生了两个“Y”型的DNA结构，同时触发了HCR和DNA酶的反应，促进信号的放大，实现了无蛋白酶和复杂扩增的检测，检测限为37 CFU/mL。基于光学的适配体传感器用于铜绿假单胞菌检测的研究还有很多。Hu等［29］在金纳米三角阵列表面搭建局域SPR传感芯片，通过连接在芯片上的适配体捕获铜绿假单胞菌，检测限低至10 CFU/mL。Zhong等［30］构建了一种磁纳米颗粒（magnetic nanoparticles, MNPs）-apt-cDNA结构，对铜绿假单胞菌进行检测，检测限低至1 CFU/mL，整个检测过程可在1.5 h内完成。

目前适配体传感器已经可以实现快速和灵敏的铜绿假单胞菌检测，未来如何将技术整合至一体化的检测装置，实现更加方便快捷的应用和长期稳定的信号输出方面还应当进行进一步的探索。

2.2 适配体在铜绿假单胞菌防治中的应用

2017年，铜绿假单胞菌的碳青霉烯类耐药菌株被世界卫生组织认定为最具有威胁性的病原体之一，亟需新兴抗生素的开发，但是由于在感染早期无法快速识别病原体，往往造成患者不能被及时治疗［31］。经过筛选和裁剪得到的适配体作为一种高亲和力、高特异性的识别元件，可以在检测和治疗上进行使用。

基于适配体的纳米材料已经开展了多项研究［32］，其中以适配体为靶向元件，以纳米材料实现抑菌作用的适配体功能化纳米材料，在靶标抑菌方面也得到较多关注［33-34］。利用适配体和二硫化钼纳米片包覆的金纳米棒靶向多重耐药的铜绿假单胞菌，Lv等［35］开发了一种可以精准损伤铜绿假单胞菌的新材料，如图3-A所示，适配体使材料具有靶向铜绿假单胞菌脂多糖的能力，纳米棒则在近红外激光下温度提升，这种温度的提升对细菌的细胞壁造成更加显著的损伤，研究表明这种新材料可以对靶标产生精准的物理损伤，有效减少过量的炎性巨噬细胞，加速感染伤口的愈合。除了利用这种抑菌材料与适配体进行偶联，利用核酸作为模板进行金属纳米簇的开发也是一种常见的靶向抑菌剂开发途径。相似地，Kraemer等［36］制备了一种伤口敷料材料，这种材料基于胶原蛋白凝胶形成类似新鲜伤口细胞外基质的状态，并利用适配体进行化学交联形成铜绿假单胞菌的捕获网络，当靶标存在时实现抗菌肽的释放，最终达成了对铜绿假单胞菌的靶向杀灭。Soundy等［37］开发了一种使用适配体作为银纳米簇合成支架的抗铜绿假单胞菌剂，碘化丙啶染色显示这种抑菌剂可以在10 min内迅速杀死50%的靶标菌。

图3 基于适配体的铜绿假单胞菌防治Fig. 3 Aptamer-based control of P. aeruginosa

除了与抑菌材料进行结合，部分适配体由于其独特的结构和更加精确的靶标可以实现独立的抑菌作用。如图3-B所示，Zhao等［21］筛选了针对丁酰基-高丝氨酸的适配体，实现了对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制。丁酰基-高丝氨酸是由铜绿假单胞菌的rhll基因编码的酰基高丝氨酸内酯合酶合成的rhl系统信号分子。该适配体筛选利用液相结构切换的核酸适配体，经过14轮的筛选，获得亲和力为28.47 nmol/L的适配体。适配体通过与丁酰基-高丝氨酸结合，可以导致该信号分子在培养物中保持低水平并阻断其余rhlR蛋白之间的偶联，从而实现对铜绿假单胞菌群体感应的干扰，抑制生物膜的形成。未来，这种具有独立抑菌能力的适配体由于其在使用中具有适配体纳米材料抑菌无法比拟的优势，将被更加广泛地开发和应用。

3 总结和展望

作为一种具有严重危害的致病菌，铜绿假单胞菌的检测和防治一直是研究的重点，但是其复杂而多样的毒力因子以及强大的生物膜形成，使其检测和抑制的难度大大提升，适配体的出现为其靶向治疗和早期检测提供了有利的工具。目前关于铜绿假单胞菌适配体的开发及其应用已经得到了一定程度的开展，但是相较于其他具有严重危害的微生物来说，铜绿假单胞菌在适配体筛选、裁剪和应用方面的研究并不丰富，依然具有较大的开发潜力。未来，在铜绿假单胞菌适配体的开发方面，在计算机技术指导下的更理性的筛选和文库设计工作将深入进行，实现更加科学地适配体筛选，这些理性筛选工作的开展将使现在适配体筛选周期长、适配体候选库分析工作量大的问题得到进一步的解决，有助于开发出具有更好性能的适配体序列。对于已经筛选得到的众多适配体，通过裁剪以完成核心结合区域探究的工作，也将得到越来越多研究者的关注，这有利于目前大分子靶标结合原因和结合区域不明现状的解决，并且对铜绿假单胞菌上的适配体结合靶位点进行确认，也将大大推动适配体在应用方面的快速发展。在应用方面，基于适配体的铜绿假单胞菌检测将朝着一体化快速检测设备开发、现场快速检测应用的方向发展，随着适配体性能的不断提升，传感器的检测性能也有望进一步提升，在特异性和灵敏度以及活死菌的区分等方面都将不断发展。在基于适配体的铜绿假单胞菌防治方面，可以直接对菌体进行损伤的适配体开发是值得研究的方向，其应用也将朝着更加有效和精准的方向进行。