血清蛋白乙酸纤维素薄膜电泳方法的优化

闫巧梅,李 斌,张学明,孔凡青,高英辰,丁海麦

(包头医学院,内蒙古 包头 014040)

0 引言

电泳是指带电粒子在电场中向与其电性相反方向移动的现象。生物体内的蛋白质、核酸等大分子物质由于分子大小、形状及所带电荷不同,在同一电场条件下在介质中移动的速度不同,利用此特点将其分开的技术即电泳技术[1]。依据支持介质不同可分为淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、滤纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳等。乙酸纤维素薄膜电泳因对蛋白质样品吸附极少、快速省时、灵敏度较高,长期以来一直被广泛用于实验教学。科学研究及临床检验应用乙酸纤维素薄膜电泳对血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、核酸及其他生物大分子进行分离检测。血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳受人为操作因素及环境因素影响较大,首次操作经常出现血清蛋白分离效果较差的问题[1]。醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白,原来采用浙江台州市路桥四甲生化塑料厂生产的乙酸纤维素薄膜,电泳缓冲液pH 8.6、离子强度为0.06 M/L的巴比妥缓冲液进行分离,效果良好,但更换为成都菲尔斯特仪器有限公司的乙酸纤维素薄膜后,再用pH 8.6、离子强度为0.06 M/L的巴比妥缓冲液进行血清蛋白分离,经常存在血清蛋白条带聚集、分不开的现象,其他使用单位也普遍存在这种情况,故有必要对醋酸纤维素薄膜的实验方法进行优化。本实验从缓冲液组成、离子强度、电泳时间及点样片装置进行优化,取得了较好、可重复的实验效果。

1 实验材料及仪器

1.1 实验材料

乙酸纤维素薄膜(2 cm×8 cm,成都菲尔斯特仪器有限公司生产),新鲜兔血清。溴酚蓝、巴比妥、巴比妥钠、硼酸、硼砂、氯化钠、丽春红S均为国药集团化学试剂有限公司生产。冰醋酸、无水乙醇为天津凯通化学试剂有限公司生产。

1.2 实验仪器

醋酸纤维素薄膜电泳仪(北京六一生物科技有限公司生产,型号DYCP-38C),电泳仪电源(BG-Power600K),微量移液器,滤纸,薄塑料片(与盖玻片厚度相当),培养皿,镊子,滤纸等。

1.3 实验试剂

pH 8.6、离子强度0.075 M/L巴比妥缓冲液[2](称取巴比妥钠15.45 g,巴比妥2.76 g,用去离子水溶解定容至1000 mL);pH 8.6、离子强度0.025 M/L巴比妥缓冲液(称取巴比妥钠5.15 g,巴比妥0.92 g,用去离子水溶解定容至1000 mL)[3];pH 8.6、离子强度0.05 M/L硼酸缓冲液(称取硼酸6.7 g,硼砂13.4 g,用去离子水溶解定容至1000 mL)[4-5];pH 8.6、离子强度0.08 M/L硼酸缓冲液[2](称取硼酸5.6 g,硼砂5.61 g,氯化钠1.32 g,用去离子水溶解定容至1000 mL)。

丽春红染色液:称取丽春红S 0.1 g,溶液5 mL冰醋酸,去离子水溶解定容至100 mL。

漂洗液:量取95%乙醇45 mL,加冰醋酸5 mL,混匀后,用去离子水稀释至100 mL。

2 实验方法

准备电泳槽。取4个乙酸纤维素薄膜电泳仪,槽内分别加入4种缓冲液,保证电泳槽内液面高度相等,剪裁尺寸合适的双层滤纸条,滤纸条一端与电泳槽的支架的前沿对齐,另一端浸入电泳槽的缓冲液内,使滤纸紧贴在支架上,待滤纸全部湿润后,驱除滤纸与支架间气泡,便可用于薄膜电泳。

浸膜。将乙酸纤维薄膜磨面朝下,分别置于4种不同缓冲液中,膜自然沉降,至少浸泡30 min,确保薄膜浸透。

血清预处理。吸取200 uL兔新鲜血清,放入500 uL EP管中,用200 uL微量移液器吸头蘸取少量溴酚蓝,再用微量移液器轻轻反复吹打血清,待溴酚蓝溶解,血清染成蓝色,将预染的200 uL血清吸到玻璃板上,并将血清涂成薄薄一层覆盖在玻璃板上(厚度约1 mm图1)。

图1 预染血清涂成薄薄一层Fig.1 Pre stained serum coated in a thin layer

加样。用钝头镊子从浸膜液中夹一张乙酸纤维薄膜,用滤纸轻轻吸去醋酸纤维薄膜上多余的缓冲液,磨面朝上,用自制加样片(厚度与盖玻片相当的薄塑料片剪成0.6 cm×5 cm,3片叠放在一起用透明胶带固定,图2)蘸取玻璃板上血清,在距膜一端1.5 cm处,将血清印在膜上,待样品渗入薄膜后移开,使其形成具有一定宽度、精细匀称的矩形,每张膜加2个样品(图3)。整个加样过程尽可能快,保持薄膜始终处于湿润状态,印迹可能要小、整齐,避免扩散面积过大。

图2 自制加样片Fig.2 Self made sampling piece

图3 膜加样后效果Fig.3 Effect of membrane sampling

电泳。将加样后的薄膜磨面朝下放置于电泳槽支架双层滤纸上,保证加样端置于电泳槽阴极端滤纸,薄膜条平直,与滤纸贴紧,用圆珠笔做好标记,盖好电泳槽盖,静止平衡10 min,打开电泳仪电源,将调节电压调至恒压100 V,电泳70 min。

染色与漂洗。电泳结束后,将薄膜置于丽春红染色液中,染色5 min,取出后用漂洗液漂洗3次,每次5 min,直至薄膜背景色为无色,取出用滤纸吸干漂洗液,辨认电泳图谱中各蛋白区带。

电泳缓冲液与电泳时间优化。依据上述实验结果及能否分离出5条区带,选取理想的缓冲液。恒压100 V,选取电泳时长为40 min、50 min、55 min的3个时间段,对电泳时间进行优化,保证漂洗后薄膜上可显现清楚的5条区带,选择电泳时长最短的为最佳电泳时长。

3 实验结果

3.1 电泳缓冲液选择

按要求加好样后,盖好电泳槽盖,平衡10 min,接通电源,将电压调到100 V进行恒压电泳,电泳70 min后,经丽春红染色5 min,漂洗液漂洗3次,保证将薄膜漂洗成无色,取出用滤纸吸干漂洗液。将乙酸纤维素薄膜放到A4纸上,观察pH 8.6,离子强度0.075 M/L、0.025 M/L巴比妥缓冲液;pH 8.6,离子强度0.05 M/L、0.08 M/L硼酸缓冲液的电泳图谱,结果显示,只有0.08 M/L硼酸缓冲液电泳图谱能显示出5条区带(图4),而其他3种缓冲液不是蛋白区带聚集,就是扩散,分辨不出5条区带。虽然pH 8.6,离子浓度0.08 M/L硼酸缓冲液电泳图谱能清晰显示出5条区带,从左到右依次为γ球蛋白、β球蛋白、α2球蛋白、α1球蛋白、白蛋白。但蛋白区带γ球蛋白、α1球蛋白存在扩散现象,不利于结果判断,其原因与电泳时间偏长有关,需对电泳时长进行进一步优化。

1.加样点;2.γ球蛋白;3.β球蛋白;4.α2球蛋白;5.α1球蛋白;6.白蛋白。图4 血清蛋白乙酸纤维素薄膜电泳图谱Fig.4 Serum protein cellulose acetate film electrophoresis pattern

3.2 电泳时间选择

不同电泳时长对醋酸纤维素薄膜电泳的图谱有一定的差异。用pH 8.6、离子浓度0.08 M/L的硼酸缓冲液,电泳恒压100 V,将电泳时长设置为40 min、50 min、55 min 3个时间段进行优化,电泳结束后,经丽春红染色,漂洗液将薄膜漂洗成无色,取出用滤纸吸干漂洗液,将乙酸纤维素薄膜放到A4纸上,观察3个时长的电泳图谱(图5)。结果显示,电泳时长为40 min时,α2球蛋白与β球蛋白分离不太明显;电泳时长为55 min时,γ球蛋白条带出现扩散,综合分析电泳时长为50 min时,乙酸纤维素薄膜图谱上血清蛋白5条带清晰可辨,结果比较理想。

a.电泳时长40 min;b.电泳时长50 min;c.电泳时长55 min。图5 血清蛋白乙酸纤维素薄膜电泳图谱Fig.5 Serum protein cellulose acetate film electrophoresis pattern

4 结果分析与讨论

乙酸纤维素是纤维素羟基经乙酰化形成的纤维素乙酸酯,将其溶于丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等有机溶剂后,涂抹成均匀的薄膜则成为乙酸纤维素薄膜,具有细密微孔结构,渗透性强,对电泳物质移动阻力小,对样品无拖尾及吸附现象。该电泳技术已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、同工酶的分离及测定中。血清中各种蛋白质的等电点大多低于pH 7.0,在pH 8.6的缓冲液中,均解离成阴离子,在电场中向阳极移动。血清中不同蛋白质所带电荷、分子大小及形状各不相同,故在电场中的泳动速度不同,电泳结束后停留在乙酰纤维素膜的不同位置。

缓冲液离子浓度与成分是影响乙酸纤维素电泳的关键因素,更换不同厂家薄膜后,应对电泳缓冲液进行优化。目前乙酸纤维素电泳缓冲液主要有pH 8.6的巴比妥缓冲液和硼酸缓冲液,离子强度通常为0.02～0.2 mol/L,缓冲液离子强度越大,样品的电泳速度减慢,离子强度增加使电泳时的总电流及产热增加,对电泳不利。更重要的是,巴比妥为麻毒类药品,存在实验室安全潜在风险,需寻求替代巴比妥缓冲液。而硼酸及其钠盐临床上可用于生产硼酸软膏、消毒剂、收敛剂、防腐剂等,安全低毒,是理想的替代品[6]。研究结果表明,实验室电泳所用乙酸纤维素薄膜用pH 8.6、离子浓度0.08 M/L的硼酸缓冲液完全可以取代巴比妥缓冲,且效果远优于巴比妥缓冲液。

加样是影响乙酸纤维素电泳的关键因素,盖玻片或X光片单层吸附血清较差,稍有不慎会造成加样过多、过少或靠近膜边缘,电泳图谱会出现蛋白条带拖尾、分离不佳或条带弯曲。加样前,将预染血清200 uL在玻璃板上涂成薄薄一层(厚度1～2 mm);再用3片叠放在一起的自制加样片,在薄薄血清中轻轻蘸取一下,加样片吸附的血清大约1 uL,保证加样量合适,在膜上印迹后宽度合适均匀。1张膜同时加两个样品,可减少膜的使用量,节省实验成本。

蛋白质乙酸纤维素电泳染色的常用染料有氨基黑10B和丽春红S两种,均属于酸性染料,与蛋白质中的精氨基酸、赖氨基酸等带正电荷的碱性氨基酸相结合,蛋白质显示黑色或红色条带。

血清乙酸纤维素薄膜电泳实验想要获得理想的分离条带,关键是要做到乙酸纤维素薄膜与缓冲液的离子成分与摩尔浓度相匹配,在确保分离效果的前提下,尽可能缩短电泳时间,提升实验效率。乙酸纤维素薄膜用pH 8.6、离子强度0.08 M/L硼酸缓冲液,电压100 V,电泳时长50 min,分离兔血清蛋白实验结果比较理想,能代替巴比妥缓冲液。