大蒜素有效成分DATS对粪肠球菌抑制作用的体外研究

王立媛 申思敏 白锡静

目前根管治疗(root canal therapy, RCT)是治疗牙髓炎和根尖周炎最有效的方法[1]。然而机械-化学预备手段并不能完全清除根管内的微生物[2-3],即使经过“完善”的RCT,仍有4%～15%的失败率[4],失败的主要原因是粪肠球菌(Enterococcusfaecalis,E.faecalis)等致病菌引起根管内的持续感染[5-6]。彻底清除这些顽固致病菌,防止再感染,提高根管治疗质量,是目前口腔医学研究的热点和重点之一[7-8]。

大蒜素是天然植物大蒜的提取物,生物安全性好,抗菌效果明显,被誉为“广谱抗生素”,其主要抗菌成分是二烯丙基化三硫(dially trisulfide, DATS),多项研究证实大蒜素及其衍生物对多种细菌具有抗菌作用。目前大蒜素对E.faecalis作用的研究报道较少。本研究将大蒜素抗菌成分DATS与临床常用的氢氧化钙制剂作比较,观察这种天然药物对E.faecalis的杀灭效果,为牙髓病和根尖周病的临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

粪肠球菌(标准株,ATCC 29212)、大蒜素标准品(二烯丙基三硫化物 DATS)、 BHI微生物培养基、二甲基亚砜(DMSO)(北京索莱宝科技有限公司); BHIA培养基90 mm(常德比克曼生物有限公司); 氢氧化钙糊剂(Well-Paste VERICOM,韩国); 电子分析天平(奥豪斯,美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 大蒜素溶液配制 大蒜素标准品DATS溶解于DMSO中,充分震荡,配制成20 mg/mL的原液,分装至无菌聚丙烯小管内,存于-80 ℃冰箱,用时取出,BHI液体培养基进行微量稀释法稀释。

1.2.2 粪肠球菌菌液配制 按说明书复苏粪肠球菌标准株,接种于血琼脂固体培养基中, 37 ℃, 5% CO2条件下培养24 h,超净台内观察菌落生长情况和菌落形态,确认为纯培养。挑取3个单菌落,用无菌接种环接种至BHI液体培养基中,比浊仪校正浓度至0.5 mol/L,稀释100 倍(约1×106CFU/mL)后备用。

1.2.3 DATS最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定 采用液体二倍稀释法测定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC): 用BHI液体培养基将DATS溶液在96 孔板连续二倍稀释,浓度依次为10 240、 5 120、 2 560、 1 280、……20 μg/mL,每孔加DATS溶液180 μL,加菌悬液20 μL。设立不含DATS的阳性菌液对照组和不含DATS也不含菌悬液的BHI 培养基阴性对照组。同时设立3 个平行对照。37 ℃培养过夜,以肉眼观察液体清亮无混浊的最低药物浓度为DATS的MIC值。

将未见细菌生长的各孔培养物,用无菌接种环接种于BHI琼脂培养基平皿,厌氧培养24 h,培养基平皿无菌落生长的最低药物浓度即为最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)。

1.2.4 DATS对粪肠球菌生物膜的抗菌作用

1.2.4.1 离体牙的收集与预备 经天津市口腔医院临床研究伦理委员会审查批准(批准号: PH2021-B-001),选取2021 年10 月～2022 年1 月间因牙周病或正畸原因拔牙的健康单根管牙60 颗,年龄为15～50 岁。在本研究中,选取弯曲度不大于10°的牙根。用刀片清除离体牙表面的牙石及软组织等附着物,保存在0.01% NaClO溶液中, 4 ℃保存备用。

用5.25% NaClO浸泡牙齿标本24 h。 使用600目金刚砂纸打磨,去除牙根表面的牙骨质。常规开髓、摘除牙髓,用登士柏Protaper 及厂家推荐操作流程,进行根管预备至F3。每次更换锉针均使用5.25% NaClO与17% EDTA交替冲洗,预备完成后超声震荡冲洗根管。使用金刚砂片磨除牙齿的冠方及根尖区,保留根中段圆柱形牙根,长度约为6 mm。分装于BHI液体培养基中, 121 ℃、 1.5 MPa灭菌15 min,静置于37 ℃、 5% CO2培养箱内, 24 h后观察无浑浊,确定完全灭菌。 4 ℃保存备用。

1.2.4.2 分组 预备好的牙根60 个,随机分为4 组(n=15)。各组处理如表1所示。

表1 实验分组 (n=15)

1.2.4.3 感染模型制备 取45 颗牙根建立根管感染模型。分装有牙根的离心管中注入标准菌液建立感染模型,置于37 ℃, 5% CO2培养箱内孵育28 d, 每2 d更换1 次菌悬液。在整个过程中严格无菌操作。孵育结束后延牙体长轴剖开,扫描电镜观察E.faecalis生物膜形成情况。

1.2.4.4 放置根管消毒剂及检测消毒效果 无菌生理盐水荡洗根管,干燥后,以黏蜡封闭底部根管口,并将牙根固定于六孔板中,每孔1 颗牙根。

按表1所示,使用无菌注射器将药物分别注入根管内。将六孔板置于培养箱内,分别于实验第1 天、第3 天和第7 天,每组取出5 个标本,无菌生理盐水荡洗去净根管内试验药物,干燥后,灭菌慢速球钻均匀磨除根管内层牙本质,电子天平称取4 mg牙本质粉末,置于2 mL BHI液体培养基无菌试管中,培养72 h。取肉汤上层液体,以电子比浊仪读取浊度,记录数值。

1.3 数据分析

使用SPSS 26.0统计软件,各组不同时间点的浊度值比较选用单因素方差分析(表2), 不同实验组间同一时间点的两两比较采用Tamhane法,各实验组内不同时间点的两两比较采用LDS法,检验水准取α=0.05。

表2 各组不同时间点根管内层牙本质粉末培养上层液体浊度

2 结 果

2.1 DATS最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

采用倍比稀释法测定DATS的MIC值为2 560 μg/mL, MBC值为5 120 μg/mL。

2.2 感染模型的建立

扫描电镜观察显示大部分牙本质小管内有细菌生长 (图1),细菌侵入深度可达500 μm,感染模型建立成功。

图1 牙本质小管感染粪肠球菌的模型建立(SEM, ×6 000)

2.3 药物对粪肠球菌生物膜的抗菌作用

第1 天时, DATS组、氢氧化钙糊剂组浑浊度显著低于阳性对照组,有明显抑菌效果,差 异具有统计学意义(P<0.05);两实验组浑浊度显著高于阴性对照组(P<0.05),仍有细菌生长;DATS组抗菌效果显著优于氢氧化钙组(P<0.05) (图2)。DATS组,第3 天和第7 天的浑浊度与阴性对照组均无统计学差别(P>0.05),已无细菌生长。氢氧化钙糊剂组,第3 天较第1 天杀菌作用更明显(P<0.05);第3 天与第7 天浑浊度无统计学差别(P>0.05);各时间点浑浊度显著高于阴性对照组(P<0.05),均有细菌生长(图3)。

图2 各组不同时间点根管内层牙本质粉末培养上层液体浊度

图3 同一组不同时间点根管内层牙本质粉末培养上层液体浊度

3 讨 论

E.faecalis是革兰氏阳性菌,肠球菌属,存在于人体的口腔、呼吸道、肠道等多个部位,是一种条件致病菌, 被认为是感染根管中最难清除的菌种之一[9]。是难治性根尖周炎、根管治疗失败再感染根管的主要致病菌[10]。杜琛[11]和李莹雪等[12]研究发现,E.faecalis在根管治疗后持续或继发性感染根管中具有较高的检出率。 Zheng 等[13]的实验表明,E.faecalis能高度耐受低氧、高盐、寡营养的恶劣环境,并快速获得抗药性和形成生物膜[14-15]。同时,E.faecalis还表现出对碱性胁迫的抗性[16-17]。这些特性使E.faecalis成为根管治疗失败的一个难题。本实验对不易产生耐药并具有抗菌作用的中药大蒜素对E.faecalis的抑菌作用进行研究。

氢氧化钙具有抗菌性,可以杀灭或抑制感染根管中的多种细菌[18],能够减轻牙髓炎和根尖周炎患者的疼痛程度,被广泛应用于临床[19]。氢氧化钙是接触性消毒药物,杀菌作用主要依靠其高碱性。即使饱和的氢氧化钙,仍不能对牙本质上的E.faecalis生物膜达到良好的清除效果[17]。一方面,E.faecalisd的菌体直径小于牙本质小管的直径[20],可在牙本质小管和管间牙本质定植,氢氧化钙弥散性差,难以直接作用杀灭细菌[21];另一方面,E.faecalis可通过细胞质的缓冲能力和“质子泵”机制保持菌体内pH值的平衡[22-23],同时天然牙本质具有降低氢氧化钙pH值的能力。本研究使用临床常用的pH值为11的成品氢氧化钙糊剂,作用于E.faecalis感染根管模型,比较不同时间点根管内壁的感染情况。结果显示:第1 天开始氢氧化钙糊剂组牙本质小管中残留细菌量明显减少(P<0.05),第1、 3、 7 天均与阴性对照组存在显著性差异,提示氢氧化钙对E.faecalis有杀菌效果,但不能完全清除细菌。其中第7 天较第3 天,菌量虽有下降但无统计学意义,分析原因与氢氧根消耗减少和氢氧化钙本身没有挥发性及扩散能力,使其无法对牙本质小管深层的细菌及其毒素起作用有关。因此,氢氧化钙无法对感染根管中的E.faecalis起到较好的杀灭或抑制作用。

大蒜为百合科葱属类植物,以鳞茎入药,是一种传统中药,古人很早就发现其具有药用价值[24],因其生物安全性好,抗菌效果明显,被誉为“广谱抗生素”[25]。大蒜素是大蒜提取物的多种成分的总称,含有多种生物活性化合物,其中DATS是多种大蒜提取物中占比最高的一种硫化物,约占所有混合大蒜素的41.5%[26]。有多项研究表明:DATS的生理活性作用更有效[27]。大蒜素的抗菌机制主要与菌体巯基酶的竞争性抑制[28]、对病原微生物菌体结构的侵入和破坏[29]、生物被膜的抑制和消散[30], 以及DATS的作用靶点及多重抑制效应等有关[31]。本研究选用大蒜素的有效成分DATS进行研究,成分单一,抗菌效果明确。

王祥柱等[32]研究显示,高浓度(5 120 mg/L)DATS对饥饿期E.faecalis生物膜抑菌抗菌效果较好。本实验采用倍比稀释法测定DATS的最小杀菌浓度为5 120 μg/mL,与该学者的研究结果一致。实验中比较不同药物对E.faecalis的杀菌效果,也选用5 120 μg/mL的DATS。刘琳[33]选用12 mg/mL的大蒜素注射液与甲醛甲酚(FC)进行比较,其杀菌效果与FC无明显差异,证实大蒜素对E.faecalis明确的灭菌效果,并具有明显低于FC的毒性。本研究结果显示, 5 120 μg/mL的DATS第1 天时已显示对E.faecalis明显的杀灭效果, 第3 天时可以将E.faecalis全部杀灭,效果优于对照组的临床常用的氢氧化钙糊剂。进而证实了大蒜素对生物膜状态的E.faecalis有明确的抑制与杀灭效果,提示可以将大蒜素用于难治性感染根管的治疗,具有强于氢氧化钙的杀菌抑菌效果和挥发性的优势。

大蒜素是大蒜中分离提取出的化合物,抗菌效果明显,不易产生耐药性。对难治性感染根管的E.faecalis生物膜有杀灭效果。但大蒜素有刺激性气味,遇热不稳定,从而减弱甚至丧失功效,使其在临床上的应用受到一定的限制。大蒜素进一步应用于口腔临床治疗还有赖于对其药理作用在分子水平上的深入研究,以及对大蒜素制剂的进一步研制。