心肌超声造影心动图联合斑点追踪成像评价2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯对砷中毒大鼠心脏保护作用

冯 佳,田芮萌,芦桂林,秦文娟*

(1.德阳市人民医院超声医学科,四川 德阳 816000;2.石河子大学第一附属医院超声医学科,新疆 石河子 832008)

三氧化二砷(arsenic trioxide, ATO)常用于治疗急性早幼粒细胞白血病,且对部分实体肿瘤亦具有较佳疗效[1];但心脏毒性较重,可破坏心肌细胞钙稳态致心肌细胞兴奋-收缩耦联紊乱而影响心功能,临床可表现为完全性房室传导阻滞、急性心力衰竭、心室颤动等甚至死亡[2-3]。2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯(2-aminoethoxydiphenyl borate, 2-APB)对维持心肌细胞钙稳态具有重要作用,可减轻ATO心肌损伤[4]。心肌超声造影心动图(myocardial contrast echocardiography, MCE)可无创评估心肌血流灌注,是监测心肌微循环的最佳方法之一[5]。斑点追踪成像(speckle tracking imaging, STI)可追踪心肌组织在二维超声图像中的位置以获取反映心肌组织运动力学特征参数[6]。本研究观察MCE联合STI评价2-APB对砷中毒大鼠心脏保护作用的价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物 12周龄无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级SD雄性大鼠40只,由山东省实验动物中心提供(生产许可证号:SCXK-2020-0005)。本实验获石河子大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准(A2021-060-01)。

1.2 主要仪器及试剂 ATO(双鹭药业股份有限公司);2-APB(Sigma公司);乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase, GOT)、肌酸激酶(creatine kinase, CK)、心肌肌浆网Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)试剂盒,南京建成生物工程研究所有限公司;EPIQ 7C超声诊断仪(Philips公司);声诺维(Bracco公司);CHK光学倒置显微镜(Olympus公司)。

1.3 造模及干预 将40只大鼠随机分为ATO中毒后低剂量2-APB干预组(2-APBL组)、ATO中毒后高剂量2-APB干预组(2-APBH组)、单纯ATO中毒组(ATO组)、单纯2-APB干预组(2-APB组)及对照组,每组8只。对2-APBL组、2-APBH组和ATO组大鼠经腹腔注射ATO 5 mg/kg体质量,对2-APB组和对照组注射生理盐水,每日1次,共10日;之后分别按2、4和4 mg/kg体质量对2-APBL组、2-APBH组和2-APB组大鼠腹腔注射2-APB,对ATO组及对照组注射生理盐水,隔日1次,共21日。期间以标准饲料饲养大鼠于石河子大学动物房[12 h光-暗循环,湿度40%～60%,温度(23±2)℃]。

1.4 超声心动图检查 麻醉大鼠后以左侧卧位将其保定于检查床上,同步连接心电图,将12S探头(频率12 MHz,120～200帧/s)置于胸骨左缘,获取乳头肌水平左心室短轴切面二维动态图像(>5个心动周期),记录室间隔舒张末期厚度(interventricular septal thickness at end-diastole, IVSD)、左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension, LVIDD)、左心室后壁舒张末期厚度(left ventricular posterior wall thickness at end-diastolic, LVPWD)、室间隔收缩末期厚度(interventricular septal thickness at end-systolic, IVSS)、左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic dimension, LVIDs)、左心室后壁收缩末期厚度(left ventricular posterior wall thickness at end-systolic, LVPWS)、左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)及左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF);将图像导入QLab12.0软件进行脱机分析,选择清晰显示心内膜的乳头肌水平左心室短轴切面图像,软件自动将左心室心肌分为心内膜层、中层和心外膜层,并分别计算各层心肌整体圆周应变(global circumferential strain, GCS)峰值。对以上参数均测量3次,取平均值。

将频率3～12 MHz L12-3探头置于大鼠胸骨左缘,设机械指数0.1、深度3～4 cm,显示左心室短轴乳头肌层面后选择造影模式,经大隐静脉快速注入造影剂0.4 ml/kg体质量并跟注0.2 ml生理盐水获得造影图像,并将其导入QLab12.0软件进行脱机分析;将面积1.5 mm2的矩形ROI置于前间隔心肌组织,获得时间-强度曲线(time-intensity curve, TIC),排除拟合度<0.9者,获得达峰时间(time to peak, TTP)、峰值信号强度(peak intensity, PI)、曲线上升斜率(wash in slope, WIS)及曲线下面积(area under the curve, AUC),均测量3次后取平均值。

1.5 检测血清心肌损伤标志物及SERCA 于超声检查后取下腔静脉血2 ml,4℃条件下离心10 min (3 500 r/min)后取上层血清置于-80℃冰箱中;按试剂盒要求测定LDH、AST、CK和SERCA活性,均测量3次后取平均值。

1.6 病理学检查 以脊椎脱臼方式处死大鼠,完整剥离心脏并行HE染色,于光镜下观察心肌细胞形态。

1.7 统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。以±s表示服从正态分布的计量资料,采用F检验及LSD-t检验(方差齐)或Welch近似F检验及Tamhane'sT2法(方差不齐)进行多组间及2组间比较。行Pearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 2-APBL组和2-APBH组大鼠精神状态尚可,反应尚灵敏,活动、进食、饮水稍减少,毛发略发黄;ATO组大鼠反应迟缓,精神状态差,活动、进食、饮水明显减少,毛发发黄,部分出现腹泻;而2-APB组和对照组大鼠反应灵敏,活动自由,进食、饮水均正常,毛发光泽。

5组心率和矫正QT间期(corrected QT interval, QTc)差异均有统计学意义(P均<0.05);相比对照组,2-APBL组、2-APBH组和ATO组心率加快、QTc延长(P均<0.05);相比ATO组,2-APBL组和2-APBH组心率减慢、QTc缩短(P均<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠基本情况比较(n=8)

2.2 超声心动图

2.2.1 M型常规超声心动图 5组LVFS和LVEF差异均有统计学意义(P均<0.05);相比对照组和2-APB组,2-APBL组、2-APBH组和ATO组LVFS、LVEF均降低(P均<0.05);相比ATO组,2-APBL组和2-APBH组LVFS、LVEF均增加(P均<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠M型超声心动图参数比较(n=8)

2.2.2 MCE 除TTP外,5组大鼠MCE参数差异均有统计学意义(P均<0.05);相比对照组和2-APB组,2-APBL组、2-APBH组及ATO组WIS、PI、WIS×PI及AUC均下降(P均<0.05);相比ATO组,2-APBL组和2-APBH组WIS、PI、WIS×PI及AUC均上升(P均<0.05),2-APBH组上升幅度更大(P均<0.05)。见表3和图1。

图1 大鼠前间隔心肌MCE A.2-APBL组; B.2-APBH组; C.ATO组; D.2-APB组; E.对照组

表3 5组大鼠前间隔心肌MCE参数比较(n=8)

2.2.3 STI 5组均表现为心内膜下心肌GCS(GCS of endo-myocardium, GCSendo)>中层心肌GCS(GCS of mid-myocardium, GCSmid)>心外膜下心肌GCS(GCS of epi-myocardium, GCSepi)(P均<0.05)。5组间GCS差异均有统计学意义(P均<0.05);相比对照组和2-APB组,2-APBL组、2-APBH组和ATO组GCS均降低(P均<0.05);相比ATO组,2-APBL组GCSendo、2-APBH组GCSendo及GCSmid均升高(P均<0.05);相比2-APBL组,2-APBH组GCSendo、GCSmid均升高(P均<0.05)。见表4和图2。

图2 大鼠左心室GCS-endo超声图像 A.2-APBL组; B.2-APBH组; C.ATO组; D.2-APB组; E.对照组

表4 5组大鼠左心室心肌GCS比较(n=8)

2.3 血清心肌损伤标志物及SERCA水平 5组GOT、CK、LDH及SERCA差异均有统计学意义(P均<0.05);相比对照组和2-APB组,2-APBL组、2-APBH组及ATO组GOT、CK、LDH增加而SERCA降低(P均<0.05);相比ATO组,2-APBL组和2-APBH组AST、CK、LDH降低而SERCA增加(P均<0.05),2-APBH组变化更著(P均<0.05)。见图3。

图3 各组大鼠血清心肌损伤标志物及SERCA水平柱状图 A.GOT; B.CK; C.LDH; D.SERCA (*:组间整体比较P<0.05;#:与对照组和2-APB组比较P<0.05;&:与ATO组比较P<0.05;△:与2-APBL组比较P<0.05)

2.4 病理学 2-APBL组及2-APBH组大鼠心肌细胞稍肿胀、排列稍紊乱,红细胞部分渗出,其中2-APBH组心肌细胞受损程度较轻;ATO组心肌细胞肿胀、结构不完整,排列紊乱,细胞间隙增宽,细胞核浓缩深染,胞浆深染,红细胞大量渗出,部分受损较重者可见坏死灶;2-APB组和对照组大鼠心肌细胞结构完整且清晰、形态正常、排列整齐,细胞核位于心肌细胞中央,细胞间隙均匀。见图4。

图4 大鼠心肌组织病理图(HE,×100) A.2-APBL组; B.2-APBH组; C.ATO组; D.2-APB组; E.对照组

2.5 相关性分析 WIS、PI及WIS×PI与均SERCA呈正相关(r=0.874、0.893、0.920,P均<0.05);GCSendo、GSCmid及GCSepi均与SERCA呈正相关(r=0.916、0.848、0.783,P均<0.05)。

3 讨论

降低SERCA活性、破坏心肌细胞Ca2+稳态为ATO心脏毒性作用机制之一[3]。2-APB可降低心肌成纤维细胞Ca2+浓度并维持钙稳态[4,7]。本研究参照GHOLAMI等[8]方法制备大鼠ATO模型,结果显示各ATO组大鼠一般情况较差,而2-APBL组和2-APBH组较之有所改善,提示大鼠ATO心脏毒性可引发一般情况改变,而2-APB对此具有保护作用。

本研究各ATO组大鼠LVEF均低于对照组但仍处于正常范围,提示ATO可损伤心脏,但LVEF难以准确评估各层及各节段心肌[9]。本研究2-APBL组、2-APBH组和ATO组WIS、PI、WIS×PI及AUC均低于对照组,其中2-APBL组和2-APBH组均高于ATO组,且2-APBH组又高于2-APBL组,提示ATO可破坏大鼠心肌微循环血流灌注,而2-APB有助于减轻损伤,且剂量越高,效果越明显。

本研究5组大鼠左心室心肌GCS均表现为GCSendo>GCSmid>GCSepi,与王臻等[10]的结果相符;可能由于心内膜层心肌相对运动幅度较大,负向扭转形变亦较大,应变能力更强;以ATO及2-APB干预后GCS均有所下降/上升,以GCSendo变化最明显,可能心内膜层心肌由冠状动脉末梢血管供血且距冠状动脉主干较远,对血供和氧供变化更敏感[11]。本研究发现MCE及STI参数均与SERCA具有相关性,提示MCE和STI,尤其WIS×PI和GCS-endo(r=0.920、0.916)有助于监测ATO心脏毒性并评估2-APB对心肌的保护作用;病理学结果亦进一步证实ATO可破坏大鼠心肌细胞,而2-APB对此具有保护作用。

本研究的主要局限性:①心尖四腔心图像质量较差,无法提供整体纵向应变参数;②因侧壁回声失落效应、后壁受造影剂声影影响,无法提供后壁和侧壁心肌超声造影相关参数;③未使用小动物专用超声设备;④尚无2-APB给药剂量标准。

综上所述,MCE联合STI、尤其WIS×PI和GCSendo参数可用于评估2-APB对砷致大鼠心脏毒性的保护作用。

利益冲突:全体作者声明无利益冲突。

作者贡献:冯佳数据分析、撰写和修改文章;田芮萌数据分析;芦桂林指导;秦文娟指导、审阅文章。