萎缩芽孢杆菌WL520生物活性及干旱胁迫下促紫花苜蓿生长效应

武玲玲,谢永丽,2,3*,杨 杰,杨 雪,2,李俊熹,王 添,高 英,常斐斐

(1.青海大学农牧学院,青海 西宁 810016; 2.青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室,青海 西宁 810016;3.青海省青藏高原优良牧草种质资源利用重点实验室,青海 西宁 810016)

草地资源涉及一定地域范围内的草地类型、面积和分布情况,以及由它们所产生的物质蕴藏量,是青海省畜牧业发展的重要基础,对青海省经济及生态效益具有重要作用[1]。干草及饲草料加工是畜牧业生产的重要来源,然而青海地区属内陆西部地区,海拔高(1 644～6 851 m),紫外线强,常年温度较低,降雨量少,干旱、半干旱、沙荒地较多,包括柴达木盆地、海西州全境等诸多地方都属于干旱气候区,牧草种植后因干旱低温等不利环境因素导致牧草产量和品质降低,草牧业发展严重受限,进而对整个青海省畜牧业发展产生了不利影响。同时,青海干旱低温的气候条件导致草地生态系统脆弱,土壤贫瘠,植被覆盖率低,能作为饲草的植物品种相对较少,加之秋冬季节草场植被枯黄,导致可利用优良牧草生长期短,产草量低[2-3]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作为世界范围内栽培历史最悠久,种植面积最广泛的豆科苜蓿属(MedicagoL.)多年生草本植物[4],其优质高产、耐刈割的生产特性及保持水土等生态功能使其作为我国农业产业结构调整、发展优质牧草产业的重要选择[5-6],同时作为优质高产饲草资源在青海广泛种植利用。然而,病害逐渐成为制约紫花苜蓿产量增加和质量提升的主要因素。锐顶镰孢菌(Fusariumacuminatum),属半知菌亚门真菌,普遍存在于土壤和动植物中,可引起苜蓿根腐病[7];禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum),又称禾谷镰刀菌,是引起包括苜蓿在内等多种植物病害的真菌病害之一[8];同时,干旱严重制约了其产量的提升和种植面积的扩大。因此,提高紫花苜蓿产量及品质可为解决牧草资源短缺及青海草地生态恢复提供指导依据和实践方法[9-11]。

芽孢杆菌作为一类重要的植物根际促生菌(PGPR),具有能够进行根系定殖、可产植物激素、分泌多种抗菌物质等特点,部分芽孢杆菌具有较强的抵抗逆境胁迫的能力[12],能够与宿主植物建立良好的共生关系,且因其良好的拮抗、促生等活性成为了研究热点[13]。柴加丽等[14]报道,芽孢杆菌作为土壤中广泛存在的PGPR,自身能够产生植物生长激素,如赤霉素、生长素及亚精胺等,或产生挥发性化合物(Volatiles),如2,3-丁二酮等物质直接促进植物生长;芽孢杆菌也可通过产生植酸酶、嗜铁素等促进植物对难溶性磷、铁等元素的吸收,从而提高植物根际养分,还可通过抑制植物病原菌的生长,降低植物病害的发生,从而间接促进植物生长[15-16]。黄秋斌等[17]研究发现蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus) B3-7可定殖在小麦根系,降低小麦纹枯病(Sharp eyespot of wheat)的侵染,从而提高小麦的生物量。杨雪等[18]报道解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) DGL1提高了燕麦(AvenasativaL.)的叶绿素、超氧化物歧化酶(SOD)等含量,且增加了牧草产量,对高原牧草的生长发育产生了显著影响。鉴于此,我们提出了筛选能够应对干旱胁迫并具有优良性状的根际促生菌,为逆境环境下促进牧草生长、提高作物产量及改善生态环境等提供研究思路及解决方案。

本研究以分离自青海干旱沙地白刺根际的芽孢杆菌菌株WL520为材料,对菌株拮抗活性、耐逆性、产IAA及固氮能力进行测定,并进一步测定干旱胁迫下,菌株对紫花苜蓿生长及耐逆性方面的影响,以期为耐干旱生物菌肥的研发提供优质菌源,同时为促进紫花苜蓿生长、退化植被修复等方面提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料:紫花苜蓿(M.sativa)‘新牧1号’由青海省海南藏族自治州同德牧场提供;

菌株:芽孢杆菌WL520分离自青海省海西蒙古藏族自治州乌兰县沙地白刺(N.tangutorum)根际;

病原菌:锐顶镰孢菌(F.acuminatum)和禾谷镰孢菌(F.graminearum)由青海大学草地资源与省部共建实验室保存;

试剂及培养基:革兰氏碘液[19]、Salkowski比色液[20]、LB培养基[21]、PDA培养基[22]、Ashby无氮培养基[22]、蛋白酶检测培养基、淀粉酶检测培养基、果胶酶检测培养基、β-1,3-葡聚糖酶检测培养基[20]。

1.2 方法

1.2.1菌株拮抗病原真菌活性测定 打取直径为5 mm锐顶镰孢菌(F.acuminatum)和禾谷镰孢菌(F.graminearum)菌饼,分别接种至PDA平板中央,以菌饼为中心的4个对称点作为接种点,各放置4个直径 4 mm滤纸小圆片;将菌株WL520接种于5 mL的LB液体培养基中,以37℃,200 r·min-1振荡培养12 h后,将菌液点接在滤纸小圆片中央培养2 d后观测菌株抑菌圈的直径并记录。

抑菌水解酶活性:用直径为5 mm的打孔器分别在蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、β-1,3-葡聚糖检测培养基中央打孔;吸取5 μL活化后的WL520菌液接种至4种检测培养基中央,28℃恒温培养箱中培养3 d。蛋白酶、果胶酶检测培养基直接观察是否有透明圈产生;淀粉酶、β-1,3-葡聚糖酶检测培养基分别利用革兰氏碘溶液、0.1%的刚果红溶液浸染静置10 min后,倒去染液,观察培养基是否有透明圈产生,根据所形成的透明圈判断该菌株是否具有产水解酶特性。

1.2.2菌株耐旱性测定 利用PEG-6000人工模拟干旱条件,将菌株WL520分别接种至含9%,11%,14%,16% PEG-6000的LB液体培养基中,置于恒温培养箱37℃,200 r·min-1条件下恒温振荡培养12 h制成菌悬液,利用分光光度计测定其OD600值,以不含PEG-6000的LB液体培养基为对照,测定菌液的吸光度值,分析菌株耐旱性。

1.2.3菌株产IAA能力测定 菌株WL520活化14 h后恒温振荡培养7 d后与Salkowski比色液(10 mL 0.5 mol·L-1FeCl3+ 30 mL蒸馏水+50 mL 98% H2SO4)按2∶1体积比混合至白色陶瓷板中,黑暗静置30 min,1个处理3个重复,以LB液体为对照,观察是否发生显色变化,若溶液变为红色,则表明菌株具有产IAA能力;将菌株菌悬液离心(4℃,10 000 r·min-1)10 min,取5 mL上清液于离心管中,加入等量比色液,避光静置30 min后测定其OD530值,根据所绘制的标准曲线计算菌株WL520产IAA的量[21]。

1.2.4菌株固氮能力测定 将WL520菌株接种至LB液体培养基,振荡培养12 h后吸取5 μL菌液转接至Ashby无氮液体培养基中摇床恒温(37℃)培养3 d,所配制的Ashby培养基中加入具有固氮能力的芽孢杆菌,该培养基颜色发生变化,菌液变浑浊。根据颜色变化来判断该芽孢杆菌是否具有固氮能力,根据菌液在试管中是否变浑浊作为判断依据,检测其固氮能力;同理,吸取5 μL菌液接种于Ashby固体培养基中,在37℃恒温培养箱中培养3 d,观察并记录菌落生长情况,根据所形成的透明圈大小,检测其固氮能力[23]。

1.2.5菌株的分子鉴定 16S rDNA基因序列:以芽孢杆菌WL520基因组DNA为模板进行16S rDNA扩增。引物序列:正向引物27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,反向引物1492R:5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增条件:95℃ 4 min,94℃ 1 min,50℃ 1 min,72℃2 min,34个循环;72℃ 10 min。16S rDNA扩增产物纯化后测序,测序结果通过NCBI数据库进行BLAST比对,并通过MEGA7.0软件制作系统发育树[24]。

gyrB基因序列:以WL520菌株基因组DNA为模板进行gyrB基因扩增,引物序列:正向引物UP2r:5′-AGCAGG-GTACGGATGTGCGAGCCR-TCNACRTCNGCRTCNGT-CAT-3′,反向引物UP1:5′-GAAGTCATCATGAC-CGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′。PCR扩增条件:95℃ 4 min,98℃ 10 s,62℃ 1 min,72℃ 2 min,30个循环;72℃ 8 min。将gyrB基因扩增产物纯化后测序,测序结果同上述方法一致,通过MEGA7.0软件制作系统发育树。

1.2.6干旱胁迫下WL520促紫花苜蓿生长效应测定 紫花苜蓿培养:挑选籽粒饱满,大小均匀的紫花苜蓿种子于温水中浸泡30 min软化种皮,用10%次氯酸钠溶液消毒20 min后用无菌水冲洗3～5次后自然风干。将风干后的种子置于直径为10 cm,高度为10 cm的0.35 L花盆中进行盆栽试验,50粒·盆-1,播种于无菌土中,将其置于28℃,光/暗周期16 h/8 h的光照培养箱中培养15 d左右。

菌悬液制备:将菌株WL520接种于含有100 mL LB液体培养基的锥形瓶中,37℃,200 r·min-1条件下培养12 h,转入50 mL离心管,在8 000 rpm·min-1条件下离心5 min,弃上清,无菌水洗涤菌体3次,加入适量无菌水将菌体悬浮,使用分光光度计测定其600 nm下的吸光度值,待其OD600值调至1.00制成菌悬液。

紫花苜蓿不同处理组:培养7 d左右,待植株高度达到5～10 cm时,配制15% PEG-6000溶液,采用PEG-6000人工模拟干旱条件,设置4个不同处理组:CK,无菌水为对照,对紫花苜蓿进行灌根处理,每3 d灌根1次,共灌根5次;CK+B,用WL520菌株菌悬液对紫花苜蓿进行灌根处理,每3 d灌根1次,共灌根5次;D,无菌水每3 d灌根1次,共灌根2次后,用15% PEG-6000溶液每3 d灌根1次,共灌根3次。DB,用15% PEG-6000干旱胁迫对紫花苜蓿进行灌根处理,每3 d灌根1次,共灌根2次后,用菌株菌悬液每3 d灌根1次,共灌根3次。每次灌根45 ml,经灌根处理后,对其进行洗根处理,取出每组不同处理下的15株苜蓿,测定株高、鲜重等生长生理指标[25-26]。

叶绿素含量测定:参考植物生理学实验指导书[27]。称取0.2 g新鲜苜蓿叶片,擦净剪碎放入研钵中,加入2 mL提取液(96%乙醇),充分研磨成匀浆状至组织变白;过滤并用提取液洗涤后定容至25 mL棕色容量瓶,摇匀;立即测定OD665、OD649和OD470值并按照公式计算苜蓿幼苗组织中叶绿素的含量。

超氧化物歧化酶(SOD)含量测定:参照植物生理学实验指导书[27]。称取苜蓿叶片2.5 g,加入少量pH=7.8的磷酸缓冲液,研磨成匀浆,转移至25 mL容量瓶中,用同一缓冲液定容;在4℃下,10 000 r·min-1,离心15 min,上清液即为酶粗提取液;取5 mL离心管4支(2支为测定管,2支为对照管),加入反应试剂后混匀;1支对照管进行遮光处理,与其他各管同时置于4000 lx日光灯下反应,温度设为35℃;30 min后测定OD560下的吸光度值,按照公式计算SOD活性。

丙二醛(MDA)含量测定:参考植物生理学实验指导书[27]。称取1 g新鲜苜蓿叶片,加入少量10% TCA和石英砂于研钵中,研磨至匀浆;以4 000 r·min-1离心10 min,吸取2 mL上清液并加入2 mL 0.6% TBA(硫代巴比妥酸)溶液,对照加蒸馏水2 mL,混匀后于沸水浴上反应15 min,迅速冷却后再离心,取上清液测定OD532、OD600和OD450值,并按照公式计算苜蓿幼苗组织中MDA的含量。

2 结果与分析

2.1 菌株WL520的拮抗活性

2.1.1拮抗病原真菌活性 以锐顶镰孢菌(F.acuminatum)、禾谷镰孢菌(F.graminearum)为病原指示菌,测定菌株WL520拮抗病原真菌活性,发现芽孢杆菌WL520对锐顶镰孢菌、禾谷镰孢菌抑菌圈直径分别为16.70 mm、15.20 mm,能较好的抑制病原真菌的生长,表现出良好的拮抗病原真菌活性(图1,表1)。

表1 菌株WL520拮抗病原真菌活性Table 1 Antagonistic activity of strain WL520 to fungal pathogens

图1 菌株WL520拮抗病原真菌活性Fig.1 Antagonistic activity of strain WL520 to fungal pathogens注:A,拮抗禾谷镰孢菌活性;B,拮抗锐顶镰孢菌活性Note:A,Antagonistic activity to F. graminearum;B,Antagonistic activity to F. acuminatum

2.1.2抑菌水解酶活性 菌株WL520可在蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、β- 1,3 -葡聚糖酶4种抑菌水解酶检测培养基上产生透明圈,表明该菌株在生长过程中具有产生蛋白水解酶、淀粉水解酶、果胶水解酶、β-1,3 -葡聚糖酶4种抑菌水解酶的能力(图2)。

图2 菌株WL520抑菌水解酶活性Fig.2 Determination of antimicrobial activity of strain WL520注:A,蛋白酶活性;B,淀粉酶活性;C,果胶酶活性;D,β-1,3-葡聚糖酶活性Note:A,Protease activity;B,Amylase activity;C,Pectase activity;D,β-1,3-Glucanase activity

2.2 菌株WL520耐旱性

干旱条件下,植物生长发育会受到严重制约,导致叶片叶绿素含量降低,含有细胞毒性的代谢物质积累,从而使成株植物发生萎蔫。菌株WL520在含有PEG-6000浓度为9%,11%,14%,16%的LB液体培养基中均能生长(图3),表明该菌株具有一定的耐旱性。

图3 芽孢杆菌WL520耐干旱性Fig.3 Drought tolerance of Bacillus WL520

2.3 菌株WL520产IAA能力

通过对菌株WL520进行定性及定量的产IAA能力测定,发现菌株在按一定比例混合的Salkowski溶液当中变红,表明菌株WL520具有产IAA能力;通过绘制标准曲线,得到标准方程为y=0.032x+0.019,测得菌株WL520在530 nm处的OD值为0.386,计算得到其菌株分泌IAA的含量为11.47 mg·L-1,表明菌株WL520具有较好的产IAA能力(图4)。

图4 芽孢杆菌WL520产IAA显色反应Fig.4 IAA chromogenic reaction of Bacillus WL520

2.4 菌株WL520固氮能力

有固氮能力的芽孢杆菌增强植物吸收氮元素、改善土壤理化性质。将培养12 h后的WL520菌液接种在液体及固体Ashby无氮培养基上后,菌液在液体培养基中浑浊且在无氮固体培养基上形成菌落,表明菌株WL520具有一定的固氮活性(图5)。

2.5 菌株WL520分子鉴定

将扩增到的菌株WL520的16S rDNA基因序列和gyrB基因序列在NCBI数据库内进行BLAST同源性序列比对并构建基因序列系统发育树。16S rDNA比对结果显示:菌株WL520与B.atrophaeusM43具有99%的同源性(图6);gyrB比对结果显示菌株WL520与B.atrophaeusBA59具有100%的同源性(图7);菌株WL520鉴定为萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)。

图6 基于16S rDNA基因序列构建的系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree constructed based on 16SrDNA gene sequence

图7 基于gyrB基因序构建的系统进化图Fig.7 Phylogenetic diagram based on gyrB gene sequence construction

2.6 干旱胁迫下WL520促紫花苜蓿生长效应

2.6.1紫花苜蓿生物量 菌株WL520菌悬液对紫花苜蓿灌根处理(CK+B)后,植物株高、根长及鲜重分别达到11.33 cm,10.27 cm和0.165 5 g,与对照(CK)相比,分别提高了53.73%,12%和65.01%;干旱胁迫下,菌悬液灌根(DB)后植株株高、根长及鲜重分别达到10.93 cm,11.63 cm和0.122 4 g,与干旱胁迫(D)相比,其株高、根长及鲜重分别提高了17.91%,40.12%和57.53%;菌悬液灌根(CK+B)处理后紫花苜蓿株高及鲜重与对照(CK)、干旱胁迫(D)形成显著差异,其根长没有显著差异(P<0.05)。因次,具有干旱耐受性的萎缩芽孢杆菌WL520对紫花苜蓿具有一定促生作用,并在干旱胁迫下对紫花苜蓿具有促生效应(图8,表2)。

表2 紫花苜蓿生物量测定Table2 Biomass determination of alfalfa

图8 干旱胁迫下WL520促紫花苜蓿生长效应Fig.8 Growth-promoting effect of WL520 on alfalfa under drought stress注:CK,对照;CK+B,菌液灌根;D,干旱处理;DB,干旱处理+菌液,下同Note:CK,control;CK+B,root-irrigation by bacterial suspension;D,drought treatment;DB,root-irrigation under drought stress,the same as below

2.6.2紫花苜蓿叶绿素含量 与对照(CK)相比,菌悬液灌根处理(CK+B)后的紫花苜蓿叶绿素含量提高了26%;与干旱处理(D)相比,菌悬液灌根(DB)后其叶绿素含量提高了12%。因此,在菌液灌根(DB)后正常生长和干旱胁迫下,均可提高紫花苜蓿叶绿素含量(图9)。

图9 紫花苜蓿叶绿素含量Fig.9 Chlorophyll content of alfalfa

2.6.3紫花苜蓿超氧化物歧化酶(SOD)含量 菌悬液灌根(CK+B)后紫花苜蓿SOD含量为103.2 μg·g-1FW,与对照(CK)相比,明显提高了72.76%(图10);干旱胁迫(D)下,植株SOD含量为62.4 μg·g-1FW,菌悬液灌根(DB)后,植株SOD含量为97.87 μg·g-1FW,含量提高了56.84%。菌悬液灌根后,增加了紫花苜蓿体内SOD的含量;SOD能够通过清除植物体内过量的氧自由基来保持细胞结构和生物大分子的完整性,从而提升了紫花苜蓿的抗逆性。

图10 紫花苜蓿SOD活性测定Fig.10 Determination of SOD activity in alfalfa

2.6.4紫花苜蓿丙二醛含量 与对照(CK)相比,菌悬液灌根(CK+B)后紫花苜蓿丙二醛含量为1.553 μmol·g-1FW,相比CK降低了5.41%;干旱胁迫(D)处理后,丙二醛含量明显升高,达到2.977 μmol·g-1FW,而在菌悬液灌根(DB)后丙二醛含量为1.618 μmol·g-1FW(图11),相比干旱胁迫(D)降低了45.65%,说明在干旱胁迫(D)下紫花苜蓿生物膜脂过氧化程度提高,而在菌悬液灌根(DB)后丙二醛含量降低,表明菌株WL520可减缓紫花苜蓿膜脂过氧化程度、降低丙二醛含量,从而提高紫花苜蓿的耐旱性。

图11 紫花苜蓿丙二醛含量Fig.11 Determination of malondialdehyde content in alfalfa

3 讨论

紫花苜蓿富含蛋白质、维生素等营养成分,因其抗逆性强、生长迅速等特点已成为世界上最主要的饲料作物之一。干旱胁迫作为最主要的非生物胁迫因子之一,限制了苜蓿的正常生长发育,因此探究提高紫花苜蓿抗旱的方法对克服干旱地区紫花苜蓿栽培的制约具有重要意义[28-29]。

芽孢杆菌营养需求简单、繁殖生长快、可产抗逆性芽孢等特点而具有显著生防潜力,成为研发生防菌剂的理想菌株[30]。芽孢杆菌在生长过程中所产生的代谢产物,如Surfactin、Fengycin、EPS、链霉素等能抑制病原菌生长,从而间接促进植物的生长[31]。本研究发现菌株WL520对禾谷镰孢菌(F.graminearum)和锐顶镰孢菌(F.acuminatum)有显著拮抗作用,同时,它能够产生蛋白酶、淀粉酶、果胶酶等抑菌酶类[32],推测其可通过水解病原菌细胞壁成分而抑制病原菌的生长,间接促进植物生长、提高植物产量。IAA是重要的植物激素,并且是调节植物生长发育全过程的信号物质,PGPR可以通过自身代谢产生植物激素,来促进植物细胞生长[19];菌株WL520具有较好的产IAA能力,表明该菌株在促植物生长方面具有潜在优势。同时,菌株WL520具有较好的固氮能力,固氮类芽孢杆菌可通过固定大气中的氮素、丰富土壤营养及改善土壤结构等来促进植物生长[33]。

干旱胁迫会降低植物对水分的吸收利用,加速植物体内活性氧的积累,从而抑制种子萌发,影响植物生长发育。韩德梁等[34]发现干旱胁迫下紫花苜蓿叶绿素含量下降,SOD和POD两种氧化酶活性会随干旱胁迫的强弱以及时间发生不同变化。吴淼等[35-36]出通过提高植物氧化物酶活性、促进激素和渗透调节物质的产生来应对过氧化损伤,调节细胞质的渗透势来提高植物的吸水能力。施燕华等[37]发现在不同程度干旱胁迫下添加巨大芽孢杆菌,降低了幼苗叶片和根系中相对电导率和MDA含量,保护了紫花苜蓿幼苗细胞质膜结构和功能。本研究中菌株WL520具有一定的耐旱性,在干旱胁迫下,该菌株能够提高紫花苜蓿的株高、根长、鲜重及叶绿素含量,增加产量,增强植物的光合能力。植物遭受逆境胁迫时产生大量超氧自由基,使膜脂质发生过氧化反应,产生丙二醛,而SOD能够通过清除植物体内的氧自由基降低丙二醛含量,从而增强植物的抗逆性。本研究发现菌株WL520灌根紫花苜蓿幼苗后能够有效降低紫花苜蓿MDA含量,提高SOD含量,表明菌株WL520可缓解紫花苜蓿在干旱胁迫下所带来的伤害,增强对逆境的适应能力,从而提高植物的产量和品质。

4 结论

本研究通过对菌株WL520进行分子鉴定,测定菌株拮抗、抑菌、耐逆等活性,并测定干旱胁迫下菌株对紫花苜蓿‘新牧1号’生长效应的影响,发现菌株WL520具有优良抗性及生物活性,在干旱胁迫下对紫花苜蓿的株高、根长、鲜重产生显著影响,同时,叶绿素、SOD、MDA含量发生显著变化,表明菌株对紫花苜蓿具有显著促生效应。因此,本研究为通过施用根际促生菌提高紫花苜蓿抗旱能力提供优质菌株及一定的依据。