中华绒螯蟹螺原体研究综述

孔德瑶，陈 颖，师家豪，董麒霏，张 晴

1.南华大学基础医学院，湖南 衡阳 421001；2.南华大学公共卫生学院，湖南 衡阳 421001；3.南华大学第二附属医院，湖南 衡阳 421001；4.陕西科技大学，陕西 西安 710021

在分类学上，螺原体属于动物门自我复制的原核生物，由革兰氏阳性细菌进化而来。螺原体没有细胞壁，与动物门中的其他微生物一样，具有简单的代谢过程、寄生生活、“煎蛋”菌落形态和少量基因组，只是其形态与典型的动物门微生物支原体不同，它们是螺旋状的，按照螺旋状的路径移动。中华绒螯蟹螺原体（Spiroplasma eriocheiris）已被确定为一种新型病原体。已有研究表明，螺原体的致病性也表现在除水生动物以外的其他生物体中，此外，有学者认为中华绒螯蟹螺原体可能与螃蟹的肝胰腺坏死病（HPND）有关。在中国，中华绒螯蟹肝胰腺坏死（HPND）已经造成了巨大的经济损失（Shen，Kumar et al. 2021）。阐明中华绒螯蟹的性质、宿主范围及其作用机理，对于微生物水产经济的发展具有重要意义。

1 宿主分布

中华绒螯蟹螺原体是第一个在甲壳类动物中被发现的螺旋体病原体，改变了学术界对螺旋体宿主的认知，该病原体之前就被确定为中华绒螯蟹震颤病（TD）的致病因素。对中华绒螯蟹螺原体的16S rDNA 基因序列的系统发育分析表明，这种螺原体菌株与非凡螺原体（S. mirum）密切相关。过往的研究报告指出，从兔蜱（Haemaphysalis leporispalustris）中分离出的非凡螺原体具有感染脊椎动物和诱发乳鼠白内障的能力。与预期结果相似，中华绒螯蟹螺原体除了会感染无脊椎动物，还能感染脊椎动物。其有能力在鸡胚胎的卵黄囊中繁殖，进而出现在胚胎鸡的大脑中。

2 毒力因子

螺原体是一种无壁的细菌，它依赖于宿主细胞之间蛋白质的相互作用。螺原体的表面蛋白在黏附、入侵和与宿主免疫系统相互作用的过程中发挥着关键作用。螺原体与血细胞之间的相互作用使螺原体能够进入血细胞中。此外，螺原体是一种没有细胞壁的溶血性菌种，因此不会产生外部毒素或内毒素。在过去的研究中，磷脂酶已被报告为中华绒螯蟹的毒力因子，并发挥着关键作用。同时，相关研究结果表明，SE-LysoPL 在中华绒螯蟹螺原体的致病性中发挥着核心作用。Western blot 分析结果显示，SELysoPL 是中华绒螯蟹螺原体的一种膜蛋白。利用抗体中和试验，笔者还发现SE-LysoPL 可能是中华绒螯蟹螺原体的一个重要毒力因子，也在中华绒螯蟹螺原体的致病性和代谢反应中发挥了重要作用。

3 形态和运动能力

作为一种没有细胞壁的独特细菌，中华绒螯蟹螺原体拥有螺旋状的细胞结构，其尺寸为：长2.0～10.0 μm，宽77.6±8.8 nm，螺旋间距806.7±140.4 nm，螺旋直径228.2±55.3 nm（n=200）。在秋水仙素存在的情况下，中华绒螯蟹螺原体将失去其细胞的螺旋性并破坏其致病性。此外，中华绒螯蟹螺原体细胞的极性是由一个锥形的末端体现的，通常被称为尖端，细胞总是沿着它游泳。

自主移动是中华绒螯蟹螺原体的一个特点，螺旋形状非常适合在半黏性介质中移动[1]。中华绒螯蟹螺原体可以在黏稠介质中以5 μm/s 的速度游动，行动非常迅速。随着环境介质黏度的增大，中华绒螯蟹螺原体的游动速度也在随之提高。中华绒螯蟹螺原体沿细胞轴呈现出两种手性，即右手和左手的螺旋细胞形状，在尖端的作用下，手性从正面逆转，在两个螺旋的边界上产生了扭结结构。两种手性共存使扭结的纯机械传播得以实现。随着扭结点的移动，扭结点位置两个相反方向的螺旋旋转可以产生一个相同前进方向的推进力，像螺丝钉一样通过与水的摩擦实现前进。环境黏度越大，游动速度就越快。总的来说，这种独特的游泳机制可能有助于它们生存和感染宿主。

4 细胞骨架

中华绒螯蟹螺原体的螺旋形细胞形态是由内部细胞骨架支撑的，细胞骨架由一个长约240 nm 的哑铃形结构和一个扁平的带状结构组成。锥形顶端的哑铃形结构由一条扁平的带子连接起来，该带子沿体螺旋线跨越最短的螺旋路径。游泳过程中的螺旋度转移和扭结传递都取决于内部的螺旋带结构，其由“纤维”丝和基因组中编码的5 种MreB 蛋白（MreB1-5）中至少4 种MreBs（MreB1、2、4、5）组成。“纤维状”丝状物是螺桨菌属的特有产物。有壁细菌只拥有一种MreB 蛋白，在系统发育上与螺原体相距甚远。上述事实足以说明螺原体的MreBs 与纤维丝的区别。因此，中华绒螯蟹螺原体中特殊的纤维丝和MreB 一直是一个研究的热点话题。通过观察发现，纤维素通过形成类似于细胞的半截体和位于细胞膜下的一定曲率，来决定细胞的螺旋度。MreBs是肌动蛋白家族的成员，被称为聚合动力学，是基于核苷酸结合的，如ATP 和GTP，它们是螺旋桨游动的潜在发力者。基于聚合动力学的均匀MreB 分子的聚合和解聚所形成的收缩和延伸导致MreB 丝的长度发生变化，并最终导致螺旋度转变，这可以通过纤维丝来定义。螺旋度转移在纤维丝中得到了完善，纤维丝专门用于转移而不改变长度，并将沿着细胞轴线向下，产生上述基于带状物的轴向合作性扭结传输。

5 宿主免疫反应

5.1 中华绒螯蟹

随着水产养殖业普及率的日益提高，由中华绒螯蟹螺原体引起的震颤病（TD）开始大量出现，养殖者因TD 而遭受了巨大的经济损失。中华绒螯蟹螺原体最初通过破损的伤口和鳃进入宿主，然后入侵血细胞，这就是其感染的主要场所。中华绒螯蟹螺原体在血细胞中形成多个包涵体，随着病原体的不断增殖，包涵体不断扩大最终导致血细胞破裂。同时，中华绒螯蟹螺原体通过血液循环不断瞄准许多器官的结缔组织，在后期，它们感染神经系统并在神经肌肉接头和胸神经节处大量繁殖，导致TD 发生。

基于中华绒螯蟹螺原体的致病性和特异性，人们进行了大量的研究，从基因表达、转录、转录后调控、翻译和蛋白质翻译后修饰（PTMs）等层面阐述了宿主对TD 病原体免疫反应的分子机制。结果发现，中华田园综合体的免疫系统在感染中华绒螯蟹螺原体后产生了强有力的反应，包括吞噬作用、丙酚氧化酶激活系统（proPO 系统）、血淋巴凝结系统、抗氧化系统、抗菌蛋白等。与其他无脊椎动物的免疫系统相同，中华绒螯蟹依靠先天免疫，即细胞免疫和体液免疫来识别病原体和抵抗感染[2]。

对于甲壳动物来说，受体介导的吞噬作用是先天免疫系统的一个组成部分，可以帮助宿主细胞消除入侵的病原体[3]。过往的研究表明，中华绒螯蟹的VAMP（囊泡相关膜蛋白）在中华绒螯蟹螺原体的感染中存在差异性表达。结果发现，VAMP 参与了细胞的吞噬作用，并与溶酶体进行结合以防御入侵的中华绒螯蟹螺原体，转录抑制VAMP 后，被中华绒螯蟹螺原体吞噬和灭活的病原体就明显减少了。

蛋白质组和转录组的分析表明，在中华绒螯蟹螺原体入侵期间，宿主增强了proPO 系统相关基因的表达，如Pox 和cSP，并改变了许多proPO 系统的相关蛋白，包括丝氨酸蛋白酶和蛋白酶抑制剂，同样通过蛋白泛素化调控来增强proPO 蛋白的表达。

除了proPO 系统外，其他重要的甲壳动物防御机制、溶血凝固系统，也被认为可以加强中华绒螯蟹螺原体入侵后的免疫反应。根据中华绒螯蟹螺原体感染后转录图谱的差异，确定了“补体和凝血级联途径”的富集基因簇。血球蛋白和凝血相关蛋白在感染期间都表现出相当大的转录和翻译水平的变化。据推测，可能是入侵的病原体被凝血功能捕捉到了血栓中，从而激活了吞噬机制以消除病原体[4]。

通过观察发现，中华绒螯蟹螺原体提高的活性氧（ROSs）水平在被感染的果蝇S2 细胞中引发了细胞的凋亡和坏死，极大地降低了细胞的活力。中华绒螯蟹相应的抗氧化系统积极对抗氧化的影响，谷胱甘肽S-转移酶、Trx 系统（硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶、NADPH）、过氧还蛋白等都是该系统中关键的抗氧化因子。

5.2 罗氏沼虾

作为被螺旋体攻击的另一种甲壳类动物——罗氏沼虾，同样用蛋白组学技术来探索此类虾对中华绒螯蟹螺原体的免疫功能，发现宿主体内的细胞骨架蛋白（肌动蛋白和肌动蛋白相关蛋白）与病原的黏附和侵袭有关。Ras 相关核蛋白通过调节对螺原体的吞噬作用来参与罗氏沼虾的先天性免疫反应，由于螺原体能逃避吞噬作用并形成良好的生活环境包涵体的特殊致病机制，沉默MrRan 却能提高对虾的存活率。

6 结论

螺原体缺少细胞壁，基因组简单，结构相对简单。中华绒螯蟹螺原体呈螺旋状，其细胞骨架由一个长约240 nm 的哑铃形结构和一个扁平的带状结构组成。而中华绒螯蟹螺原体作为我国水产生物中华绒螯蟹震颤病的致病原，严重阻碍了我国水产经济的发展。除此之外，中华绒螯蟹还容易感染克氏原螯虾、南美白对虾、罗氏沼虾和日本沼虾，还能引起其他鸡胚及果蝇等非水生生物的感染。据观察，中华绒螯蟹螺原体可能通过尖端与宿主细胞结合，自主移动是中华绒螯蟹螺原体的特点之一。而在宿主反应过程中发现的SE-LysoPL 则是其核心的毒力因子，中华绒螯蟹螺原体的类似黏附蛋白（ALP）也参与了病原体-宿主的相互作用。对中华绒螯蟹螺原体的毒力因子、细胞骨架、运动形态、宿主反应等开展深入研究有助于为其引起的一系列不良反应提供预防、检测和治疗靶点，从而保障水产经济的可持续发展。