柿子酵素发酵工艺优化及品质评价

田文静，武亚帅，陈昊，黄河，赵东瑞，马长路*

（1.北京农业职业学院食品与生物工程系，北京 102442；2.北京工商大学食品质量与安全北京实验室，北京 100048）

柿子，为柿树科柿属植物的果实。我国是柿属植物资源最为丰富的国家，柿子在我国分布范围广泛，其年产量位居世界第一[1-2]。柿子风味独特，深受国人喜爱。同时，柿子富含多种功能成分，如多酚类、黄酮类、丹宁类、氨基酸、维生素、矿物质等[3-6]，对维持机体稳态具有重要促进作用。研究表明，柿果中富含的多酚类物质具有抗氧化活性，可有效预防动脉粥样硬化、心脑血管等疾病[7]。这为柿子及其相关功能食品的开发应用提供了良好的基础。

酵素是由一种或者多种水果、蔬菜、菌类等日常生活中的食用原料经过多种益生菌发酵制得，含有丰富的酶、矿物质、维生素、抗氧化物质等功能成分[8-10]。目前，酵素可依据原料分类，主要包括果蔬酵素、谷物类酵素、菌菇类酵素等。其中，果蔬酵素由于其口感清爽、营养丰富，深受人们认可[11-14]。同时，果蔬等植物性食品，虽营养丰富，但贮藏性差，且其功能成分的生物利用度较低。而果蔬酵素为解决上述问题提供了思路。果蔬经过益生菌发酵制成的果蔬酵素，富含大量具有益生功能的次级代谢产物，极大改善果蔬功能成分的利用度[15-17]。

目前，尽管我国柿子资源丰富，为柿子的加工生产提供了原料保障，但由于柿子单宁含量较高，有涩味，不宜直接食用；且柿果的水分、糖、多酚含量都较高，采摘后容易腐烂、褐变，给柿果的运输和贮藏带来困难[18-19]。此外，我国柿子加工程度较低、加工产品品类较少，主要有柿干、柿醋、柿酒等，在市场上也不具备优势。因此，柿子加工的新途径和新产品成为亟待解决的问题。

基于柿子的优良风味、功能属性及资源丰富性，本研究拟以“磨盘柿”为主要原料，基于功能品质参数及感官评价结果，优化发酵工艺，制备益生菌发酵柿子酵素；并对柿子酵素的风味品质和功能品质进行评价，以期为构建柿子酵素的综合评价体系及柿子的高值化利用和精深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

磨盘柿，购于北京市房山区张坊镇农户；乳酸菌复合发酵剂：安琪酵母股份有限公司；2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS+]自由基清除能力测定试剂盒、2，2-联苯基-1-苦基肼基（2，2- diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力测定试剂盒、羟基自由基清除能力测定试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司；风味物质标准品（分析纯）：百灵威科技（北京）有限公司；有机酸标准品（分析纯）：北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 试验仪器

电子分析天平（BL-2200H）、紫外可见分光光度计（UV 1780）：日本岛津仪器有限公司；恒温加热磁力搅拌器（DF-101S）：河南省巩义市予华仪器有限公司；雷磁酸度计（PSHJ-5）：上海精密科学仪器有限公司；恒温培养箱（DH5000BⅡ）：天津市泰斯特仪器有限公司；手持糖度仪（TD-80）：南京南达分析仪器应用研究所；红外线干燥箱（102-1）：北京市兴争仪器设备厂；酶标仪（SpectraMax M2e）：美国Molecular Devices 公司；高效液相色谱仪（UltiMate 3000）：美国Thermo 公司；嗅闻仪（ODP C200）：德国GERSTEL 公司；涡旋仪（VORTEX 2）：德国IKA 公司；气相色谱-质谱联用仪（7890B-5977A）：美国Agilent 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 柿子酵素生产工艺

柿子酵素生产工艺流程见图1。

图1 工艺流程图Fig.1 The process flow chart

操作要点为：1）预处理，选取新鲜、成熟、无腐败变质的柿果冲洗清洁干净后，沥干水分，用75% 酒精均匀喷洒，密封放置24 h，进行脱涩，再除去柿梗柿蒂等杂物；2）加水打浆，将预处理后的柿果加入纯净水打碎制浆（加水量为柿果肉质量的2 倍），同时加入0.4%的VC护色，制备成柿子浆；3）调糖，在柿子浆中添加白砂糖，将其糖度调整至20%；4）灭菌，将柿子浆以95 ℃温水浴处理10～15 min，以杀灭柿子浆中的微生物；5）接种发酵，将杀菌后的柿子浆冷却至30～40 ℃，接种乳酸菌复合发酵剂，密封，并放置于30～40 ℃恒温箱进行发酵。其中，接种的乳酸菌复合发酵剂的量为每100 g柿子浆中添加0.05 g 乳酸菌复合发酵剂（植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热链球菌活菌数的比值为1∶2∶1∶3）；6）过滤除菌，采用100 目筛过滤发酵柿子浆，除去滤渣，分离出柿子酵素发酵原液，然后使用0.22 μm 醋酸纤维酯微孔滤膜对柿子酵素发酵原液进行过滤除菌，即得柿子酵素成品。

1.3.2 柿子酵素工艺优化

以SOD 活力为考察指标，采用单因素试验对白砂糖添加量（1%、5%、10%、20%、30%、40%）、发酵剂接种量（0.01%、0.03%、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%）、发酵温度（10、20、30、40、50、60 ℃）、发酵时间（1、3、6、9、12、15 d）4 个参数水平进行优化。在此基础上，以SOD活力及感官评价为考察指标，采用正交试验，确定柿子酵素的最适发酵工艺参数。

1.3.3 理化成分测定

柿子酵素产品理化指标测定中，pH 值采用pH 计测定；糖度采用手持糖度计测定；总酸含量测定参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》[20]；总酚测定采用福林酚法，参照文献[21]方法，以没食子酸为标准品，绘制没食子酸标准曲线，样品总酚含量以没食子酸当量表示。

1.3.4 抗氧化能力测定

取100 μL 样品，采用ABTS+自由基清除能力、DPPH 自由基清除能力、羟基自由基清除能力、SOD 活力、CAT 活力试剂盒方法进行测定。

1.3.5 有机酸测定

有机酸含量测定参照GB 5009.157—2016《食品安全国家标准食品中有机酸的测定》[22]。分别配制有机酸标准母液，依次稀释配制标准工作液，以标准工作液含量-响应值拟合绘制标准曲线。

1.3.6 固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）提取条件

取10 mL 柿子酵素样品，加入顶空进样瓶中，加入去离子水稀释1 倍，并加盐至饱和；加入搅拌子，将顶空进样瓶密封好，置于45 ℃恒温水浴锅中平衡15 min，转速为600 r/min；选取涂层为50/30 mm DVB/CAR/PDMS 的萃取纤维在45 ℃、600 r/min 条件下萃取50 min；萃取完毕后取出纤维头，插入气相色谱仪进样口，解吸5 min，解吸温度为250 ℃，用于气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析。

1.3.7 气相色谱-质谱-嗅闻（gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry，GC-MS-O）分析条件

气相色谱条件：色谱柱型号为DB-WAX 毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为He（99.999%）；恒流气相色谱柱流速1.5 mL/min；不分流模式进样1 μL，进样口温度为250 ℃；升温程序为初温40 ℃，以10 ℃/min升温速率升至50 ℃，并保持20 min，再以1 ℃/min 升温速率升至70 ℃，并保持10 min，后以3 ℃/min 升温速率升至250 ℃，并保持15 min。

质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量为70 eV；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；传输管线温度为250 ℃；定性采用Full Scan 扫描模式；扫描质量范围m/z 45～350。

嗅闻仪条件：嗅闻仪传输线及嗅闻口温度为250 ℃。评价小组人员进行气相色谱-嗅闻（gas chromatographyolfactometry，GC-O）分析，记录色谱流出物保留时间与香气特征。

1.3.8 定性分析

提取分离得到的风味物质采用NIST14 谱库检索进行初步定性，进一步通过与标准品在同样GC-MS-O分析条件下得到的质谱图、香气特征对比进行定性。

1.3.9 风味物质香气表达评价

按照1.3.6、1.3.7、1.3.8 所述方法提取并分析风味物质。进样分析前，柿子酵素产品以2 倍为稀释倍数依次进行稀释（1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256），随后进样分析。目标风味物质的稀释因子（flavor dilution，FD）为在进行GC-O 分析时能被嗅觉感知的最大稀释倍数。

1.3.10 感官评价

选取30 名经专业训练的评价人员（其中男女均为15 人，年龄均为18～25 岁）组成感官评价小组，对柿子酵素的感官属性进行评价，分别为色泽、滋味（酸味、甜味）、口感（细腻感、醇厚感）、风味（果香、酒香、甜香）。并在4 个感官评价属性包含的8 个类别上分别进行打分。感官评分标准见表1。

表1 感官评分标准Table 1 Sensory scoring criteria

1.4 数据分析

每个独立试验均进行3 次以上平行试验。结果以均值±标准差表示。应用SPSS 22.0 对感官评价结果进行单因素方差分析和t检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 柿子酵素发酵工艺优化

2.1.1 柿子酵素发酵工艺单因素优化结果分析

SOD 能专一地清除体内有害的自由基，以解除自由基氧化体内的某些组成成分而造成的机体损害（如使脂质过氧化，导致人体衰老，加速组织细胞凋亡并可能引起肿瘤、自身免疫性疾病、炎症等病变），因而，SOD活性现已成为抗氧化功能食品的一个重要指标[23-24]。

本研究采用单因素试验，以柿子酵素产品的SOD活力为考察指标，分别对糖添加量、发酵剂接种量、发酵温度、发酵时间进行参数优化，结果如图2所示。

图2 单因素优化试验Fig.2 Single factor optimizing test

由图2A 可知，在其他因素水平一定的条件下，白砂糖添加量对柿子酵素产品的SOD 活力具有显著影响（P＜0.05）。随着白砂糖添加量的逐步增加，柿子酵素产品的SOD 活力呈现先上升后下降的变化趋势。其中，白砂糖添加量水平为10%、20% 时，对应柿子酵素产品的SOD 活力显著高于其他4 个水平。因此，最终选择白砂糖添加量10%、20%、30%作为最优水平范围。

由图2B 可知，在其他因素水平一定的条件下，发酵剂接种量对柿子酵素产品的SOD 活力具有显著影响（P＜0.05）。随着发酵剂接种量的逐步增加，柿子酵素产品的SOD 活力呈现先上升后下降的变化趋势。其中，发酵剂接种量为0.05%、0.10%、0.20% 时，对应柿子酵素产品的SOD 活力显著高于其他3 个水平。依据结果，最终选择发酵剂接种量0.05%、0.10%、0.20%作为后续正交试验的水平范围。

由图2C 可知，在其他因素水平一定的条件下，发酵温度对柿子酵素产品的SOD 活力具有显著影响（P＜0.05）。随着发酵温度的逐步提升，柿子酵素产品的SOD 活力呈现先上升后下降的变化趋势。其中，发酵温度为20、30、40 ℃时，对应柿子酵素产品的SOD 活力显著高于其他3 个水平。依据结果，最终选择发酵温度30 ℃，作为后续正交试验的水平基准。

由图2D 可知，在其他因素水平一定的条件下，发酵时间对柿子酵素产品的SOD 活力具有显著影响（P＜0.05）。随着发酵时间的逐步延长，柿子酵素产品的SOD 活力呈现先上升后下降的变化趋势。其中，发酵时间水平为3、6、9 d 时，对应柿子酵素产品的SOD 活力显著高于其他3 个水平。依据结果，最终选择发酵时间6 d，作为后续正交试验的水平基准。

2.1.2 正交试验优化结果分析

在单因素试验基础上，确定正交试验的因素和水平如表2。采用正交试验，分别以柿子酵素产品的SOD 活力、感官评价结果为考察指标，对白砂糖添加量、发酵剂接种量、发酵温度和发酵时间进行进一步参数优化，结果如表3、表4。

表2 正交试验因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

表3 SOD 活力正交试验Table 3 Orthogonal test of SOD enzyme activity

表4 感官评价正交试验Table 4 Orthogonal test table of sensory evaluation

由表3 可知，白砂糖添加量（A）、发酵剂接种量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）均对柿子酵素产品的SOD 活力产生影响。极差（R）结果显示，4 个因素的影响度大小排序为发酵温度（C）＞发酵时间（D）＞发酵剂接种量（B）＞白砂糖添加量（A）。依据SOD 活力正交试验结果，最优水平组合为A1B2C1D3，即白砂糖添加量为10%，发酵剂接种量为0.10%，发酵温度为30 ℃，发酵时间为7 d。

由表4 可知，白砂糖添加量（A）、发酵剂接种量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）均对柿子酵素产品的感官产生影响。极差（R）结果显示，4 个因素的影响度大小排序为发酵温度（C）＞发酵剂接种量（B）＞白砂糖添加量（A）＞发酵时间（D）。依据感官评价正交试验结果，最优水平组合为A1B2C1D2，即白砂糖添加量为10%，发酵剂接种量为0.10%，发酵温度为30 ℃，发酵时间为6 d。

基于上述试验结果，分别以A1B2C1D3（SOD 活力最优水平组合）和A1B2C1D2（感官评价最优水平组合）进行益生菌柿子酵素产品制备。分别对制备后的柿子酵素产品进行SOD 活力的测定及感官评价，结果如表5、图3所示。

表5 最优组合SOD 活力及感官评价结果Table 5 SOD enzyme activity and sensory evaluation results for the optimal combination

图3 感官评价雷达图Fig.3 Sensory evaluation radar map

由表5 可知，A1B2C1D2（感官评价最优水平组合）水平条件下，制备的柿子酵素样品的感官评分显著高于A1B2C1D3（SOD 活力最优水平组合）水平组合（P＜0.05），达到74.00±2.65。由图3 各感官属性评分结果可知，A1B2C1D2水平条件下制备的柿子酵素样品，其感官品质更加均衡；而A1B2C1D3水平条件下制备的柿子酵素产品，其酸味较突出，感官品质均衡性稍差于A1B2C1D2水平条件下制备的柿子酵素样品。而就SOD 活力而言，两种组合制备的柿子酵素样品无显著差异。

综合考虑，最终确定白砂糖添加量为10%，发酵剂接种量为0.10%，发酵温度为30 ℃，发酵时间为6 d 作为柿子酵素发酵制备的最优工艺。

2.2 柿子酵素的理化性质、抗氧化性能和有机酸分布

对最优工艺条件下制备的柿子酵素样品的指标性能进行测定，包括pH 值、糖度、总酸、总酚、抗氧化性能（ABTS+自由基清除能力、DPPH 自由基清除能力、羟基自由基清除能力、CAT 活力）、有机酸分布。有机酸定量参数见表6，指标性能结果如表7所示。

表6 有机酸定量参数Table 6 Quantitative parameters for organic acids

表7 指标测定结果Table 7 Index measurement results

表7 结果显示，在最优工艺条件下制备的柿子酵素产品，总酚含量达到（247.33±4.15）mg 没食子酸/kg，对产品的抗氧化性能、感官品质有直接贡献。糖度为（8.93±0.65）°Bx，总酸含量为（8.57±0.38）g/L，这为感官品质的均衡性提供保证。同时，在最优工艺条件下制备的柿子酵素样品，其抗氧化性能优良，脂溶性体系DPPH 自由基清除率达到（90.23±4.40）%，水溶性体系ABTS+自由基清除率达到（94.72±2.81）%，而CAT 活力为（426.62±6.90）U/mL，羟基自由基清除率达到（45.18±4.76）%。与柿子醋、柿子酒、苹果酵素等相比，其抗氧化性能较好[4，17，25]。优良的抗氧化性一方面有助于稳定产品品质，另一方面能够提供功效活性。此外，其有机酸含量分布中，乳酸、乙酸含量较高，显著高于草酸、苹果酸、琥珀酸（P＜0.05）。有机酸一方面能够参与机体物质代谢、能量代谢、体现功效活性；另一方面为促进益生菌在肠道定殖、维持肠道稳态有积极作用[26]；同时适量的有机酸还对感官品质有正面贡献，能够增加滋味的醇厚感和风味丰富性。

2.3 香气评价结果分析

本研究借助SPME 结合GC-MS-O，采用稀释评价法，对最优水平条件下制备的柿子酵素样品的风味物质进行筛选鉴定及香气表达评价，鉴定方法为香气特征比对、质谱比对和标准品比对，结果见表8。

表8 风味物质鉴定分析及香气表达评价Table 8 Identification analysis and aroma expression evaluation on aroma compounds

由表8 可知，共计筛选鉴定出48 种风味物质，包括酯类14 种、醇类11 种、酸类9 种、芳香族类9 种、呋喃类3 种、酮类1 种、含硫化合物1 种。其中，从风味物质种类分布来看，酯类、醇类、酸类、芳香族类风味物质种类相对较多，是柿子酵素的主体风味物质。这与柿子醋、柿子酒的风味物质组成相似[2，4，16，20]。而从香气表达结果来看，按风味物质类别，酯类风味物质（FD=1 224）的香气表达最强，对产品的风味品质有决定性贡献，主要香气特征为果香、甜香。其后依次是酸类风味物质（FD=568，主要香气特征为奶酪香）、芳香族类风味物质（FD=484，主要香气特征为花香、甜香）、醇类风味物质（FD=130，主要香气特征为粮香、果香、酒香）、含硫风味物质（FD=32，主要香气特征为菜香）、酮类风味物质（FD=16，主要香气特征为奶香）、呋喃类风味物质（FD=10，主要香气特征为焦香）。

而在鉴定出的风味物质中，己酸乙酯（FD=256，香气特征为果香）、辛酸乙酯（FD=256，香气特征为甜香）的香气贡献最大。同时，苯乙醇（FD=128，香气特征为花香）、苯乙酸乙酯（FD=128，香气特征为花香）、乙酸（FD=128，香气特征为醋味）、丁酸（FD=128，香气特征为奶酪香）、辛酸（FD=128，香气特征为奶酪香）、丁酸乙酯（FD=128，香气特征为香蕉香）、3-甲基丁酸乙酯（FD=128，香气特征为甜香）、庚酸乙酯（FD=128，香气特征为果香）的香气表达强度也较强，是柿子酵素的重要风味物质。上述风味物质相互作用，共同构成柿子酵素的主体风味，使柿子酵素样品的香气层次丰富，风味品质优良。

3 结论

本研究以“磨盘柿”为主要原料，借助单因素及正交试验，以功能品质（SOD 活力）和感官品质（感官评分）为考察指标，对益生菌柿子酵素的发酵工艺进行优化，最终确定白砂糖添加量为10%，发酵剂接种量为0.10%，发酵温度为30 ℃，发酵时间为6 d 作为柿子酵素发酵制备的最优水平。在最优水平下制备柿子酵素产品，并对其理化性质、抗氧化性能和有机酸进行测定，结果显示，柿子酵素的总酚含量为（247.33±4.15）mg 没食子酸/kg，对产品的抗氧化性能、感官品质有直接贡献；糖度为（8.93±0.65）°Bx，总酸含量为（8.57±0.38）g/L，为感官品质的均衡性提供了保证。同时，柿子酵素样品的抗氧化性能优良，DPPH 自由基清除率达到（90.23±4.40）%，ABTS+自由基清除率达到（94.72±2.81）%，而CAT 活力为（426.62±6.90）U/mL，羟基自由基清除率达到（45.18±4.76）%。优良的抗氧化性一方面有助于稳定产品品质，另一方面能够提供功效活性。此外，在有机酸含量分布中，乳酸、乙酸含量较高，显著高于草酸、苹果酸、琥珀酸（P＜0.05），其对柿子酵素的感官品质有正面贡献，能够增加滋味的醇厚感和风味丰富性。柿子酵素产品的风味评价结果显示，酯类、醇类、酸类、芳香族类风味物质种类相对较多，是柿子酵素的主体风味物质，其中，己酸乙酯和辛酸乙酯的香气贡献最大；同时，苯乙醇、苯乙酸乙酯、乙酸、丁酸、辛酸、丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、庚酸乙酯的香气表达强度也较强，是柿子酵素的重要风味物质。多种风味物质相互作用，共同构成柿子酵素的主体风味，使本柿子酵素产品的香气层次丰富，风味品质优良。本研究为柿子的高值化利用和精深加工提供参考。