臭氧处理对哈密瓜采后腐烂与细胞壁代谢影响

古丽丹·塔勒达吾，王雪，王新宇，毕莹，李慧，冯雨蝶，吾孜木·马那尔别克，王静

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

新疆哈密瓜（CucumismeloL.）属葫芦科甜瓜属，厚皮甜瓜类，哈密瓜作为新疆主产水果之一，营养丰富、形态各异，具有增强身体免疫力、保护肝脏、延缓衰老等多种功效，近年来，备受消费者青睐。随着果实的成熟，其细胞壁结构和组成发生改变，使其贮藏期缩短，对哈密瓜果实的经济价值造成很大影响。许多学者对哈密瓜果实的软化问题进行研究：陈新艳[1]研究表明，对哈密瓜进行1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）处理，能够抑制多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、纤维素酶（cellulase，Cx）、果胶甲酯酶（pectin methylesterase，PME）、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，β-Glu）等细胞壁代谢酶活性的升高和细胞壁物质的降解，从而延缓并抑制采后哈密瓜果实的软化；曾媛媛等[2]采用1.5%羧甲基壳聚糖和1.5%海藻酸钠2 种复合涂膜处理哈密瓜能够保持较高果实硬度，维持较低PG 和Cx 活性，降低脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性，抑制哈密瓜果实软化；吕双双等[3]以“网纹甜瓜”为原料，采用采前喷钙和采后浸钙的方法使钙离子抑制细胞壁的降解、提高果实硬度，能够有效延缓果实软化的速度；但是关于臭氧处理延缓“西州蜜25 号”哈密瓜软化方面的研究较少，据研究表明，150 mg/m3臭氧处理哈密瓜并在6 ℃低温下贮藏，发现与对照组相比，处理组哈密瓜从贮藏3 d 时α-吡喃阿拉伯糖苷酶（α-LArabinofuranosidase，α-L-Af）、β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）、PG 酶活性出现降低，说明臭氧处理能够延缓哈密瓜果实采后软化[4]。

臭氧（O3）是一种由3 个氧原子组成的气体，因其有难闻的青草味而被熟知，从1840年被命名为Ozone 到现在应用到实际生产中已有180 多年的历史。有研究表明，采用10 μL/L 臭氧处理番茄10 min 后发现处理组水溶性果胶较对照组减少20%，表明短期臭氧处理有助于减少果实软化损伤[5]；另有研究表明，以“河套蜜瓜”为原料，采用5 ℃低温贮藏结合150 μL/L 臭氧处理1.5 h 能够使PG 酶活性降至较低水平，由此说明臭氧对果实PG 酶活性有一定的抑制作用[6]；但采用10 mg/m3臭氧处理对细胞壁代谢的影响研究较少。因此，本试验以“西州蜜25 号”哈密瓜为试材，探究经臭氧处理哈密瓜果实软化与细胞壁的关系，以期为臭氧在抑制哈密瓜果实采后软化方面的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

哈密瓜：“西州蜜25 号”，新疆维吾尔自治区五家渠市商品瓜基地。采用臭氧发生器，在常温（22.0±0.5）℃、湿度为45%的条件下测定指标。

3，5-二硝基水杨酸：上海科峰实业有限公司；结晶酚：天津市风船化学试剂科技有限公司；羧甲基纤维素钠、碳酸钠：天津市福晨化学试剂厂；亚硫酸钠、一水合柠檬酸、二水合柠檬酸钠：上海国药集团化学试剂有限公司；水杨苷：上海素培生物科技中心；β-半乳糖苷、对硝基苯酚：北京索莱宝科技有限公司。以上所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电子天平（PTT-A+200 型）：福州华志科学仪器有限公司；硬度计（GY-3 型）：上海精密仪器仪表有限公司；紫外分光光度计（752N 型）：上海仪电分析仪器有限公司；DW-25L92 低温保存箱：海尔电器有限公司；电热恒温水浴锅（DZKW-S-4 型）、电炉（FL-1 型）：北京市永光明医疗仪器有限公司；高速分散器（XHF-DY型）：宁波新芝生物科技股份有限公司；冷冻离心机（D3024R 型）：上海珂淮仪器有限公司；玻璃仪器气流烘干器（C 型）：河南省予华仪器有限公司；臭氧发生器（HY-004S-4A）：广州佳环科技有限公司；手持式折光仪（WZ-108 Brix）：上海亮研智能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 处理方法

以“西州蜜25 号”哈密瓜为试材，采摘2.0 kg 左右的果实，经手持式折光仪测得可溶性固形物含量为10%～12%。将每个果实套上泡沫网袋，每4 个果实装入一个纸箱，及时运至专用冷库（4～6 ℃）进行预冷12 h 后筛选出大小均一、无机械损伤、无病害、表面光泽的果实作为试验原料。

哈密瓜洗净后自然晾干，将瓜分为2 组，一组未用臭氧处理作为对照组，另一组为10 mg/m3臭氧处理组。处理时，将哈密瓜分批置于50 L 具有上通气口的塑料桶中（塑料密封盖用塑料膜和多层胶带封口），开启臭氧发生器，用浓度为10 mg/m3臭氧连续充气4 h，一次放入10 个果实，对照组和臭氧处理组分别处理15 次，每组分别为150 个果实，每次处理间隔10 min。然后将2 组果实置于温度为（22.0±0.5）℃、相对湿度为45%的常温环境中。每3 d 取样观察并测定相关指标，每次取样后不进行臭氧处理。测定相关指标时，每次每组随机取3 个瓜，每个瓜重复测定3 次，每个指标重复测定3 次，共取样6 次。

瓜皮处理：分别从臭氧处理组和对照组的每组瓜果实中心圈围削取约2 cm 的瓜皮组织，迅速剁碎后立即用液氮冷冻，并在-40 ℃冰箱中保存备用，每个指标重复3 次。

1.3.2 腐烂相关指标测定

腐烂症状：从各组果实中分别随机取10 个果实作为观察果，观察腐烂症状。

腐烂指数：参照陈存坤等[7]的方法测定，计算公式如下。

式中：W为腐烂指数；s为级数；n为该级数果实个数；T为总瓜数；H为最高等级数。

腐烂率计算公式如下。

式中：W为腐烂率，%；n为腐烂个数；T为总瓜数。

1.3.3 硬度

参照曹建康等[8]方法，用刀削去哈密瓜果皮后使用硬度计进行测定，单位kg/cm2。

1.3.4 原果胶含量的测定

采用曹建康等[8]的咔唑比色法。称取1 g 的瓜皮组织于离心管中，加入95% 乙醇煮沸1 h，取出冷却后，8 000×g离心15 min，倒掉上清液；含量测定按照半乳糖醛酸标曲的方法进行，得到半乳糖醛酸标准曲线方程为y= 0.190 4x- 0.020 4（R2= 0.998 5），半乳糖醛酸含量计算公式如下。

式中：L为半乳糖醛酸含量，%；m′为从标准曲线查得的半乳糖醛酸质量，μg；V为样品提取液总体积，mL；VS为测定时所取样品提取液体积，mL；m为样品质量，g。

W=w1-w2

式中：W为原果胶含量，%；w1为果胶含量，%；w2为可溶性果胶含量，%。

1.3.5 可溶性果胶含量的测定

向1.3.4 剩余沉淀中加入5 mL 蒸馏水，水浴锅加热1 h，冷却放置室温22 ℃，8 000×g离心15 min 后，留存上清液。测定含量步骤同1.3.4。

1.3.6 多聚半乳糖醛酸酶活力的测定

采用曹建康等[8]的比色法测定。

1.3.7 β-半乳糖苷酶活力的测定

采用曹建康等[8]的方法测定β-半乳糖苷酶（β-Gal）活力。

1.3.8 纤维素酶活力的测定

采用曹建康等[8]的方法，称取10 g 果皮组织，加入预冷的95% 乙醇研磨均匀，于4 ℃、12 000×g离心20 min，静置10 min；倒掉上清液，继续加入80%乙醇，12 000×g离心20 min 后静置10 min；倒掉上清液，加入5 mL 提取液，12 000×g离心20 min 后静置20 min，保留上清液。测得标准曲线为y= 2.266 1x+ 0.023 4（R2= 0.999 1）。

1.3.9 β-葡萄糖苷酶活力的测定

采用水杨苷水解法测定[8]，酶液提取步骤同1.3.8。

1.4 数据处理与分析

采用WPS Office 2020 软件进行数据统计，Origin 2019 进行制图，并使用SPSS 17 作显著性分析。

2 结果与分析

2.1 臭氧处理对哈密瓜腐烂症状和腐烂指数、腐烂率的影响

臭氧处理对哈密瓜腐烂症状和腐烂指数、腐烂率的影响见图1～图3。

图1 哈密瓜常温贮藏6 d 和15 d 的腐烂症状Fig.1 Symptoms of rot in Hami melon after 6 days and 15 days at room storage

图2 臭氧处理对哈密瓜的腐烂指数的影响Fig.2 Effect of ozone treatment on decay index in Hami melon fruit

图3 臭氧处理对哈密瓜的腐烂率的影响Fig.3 Effect of ozone treatment on decay rate of Hami melon fruit

腐烂可以直接反映臭氧处理对哈密瓜的贮藏保鲜效果，也是影响其品质评价的重要指标[9]。从图1a 可以看出，哈密瓜常温贮藏6 d 时，对照组的腐烂症状明显比臭氧处理组严重；对照组果实的表皮出现小面积的腐烂，而臭氧处理组没有出现腐烂；贮藏至15 d，对照组的腐烂情况加剧，果实表面出现皱缩、下陷等症状，而臭氧处理组果实腐烂情况较轻，只出现果实表皮皱缩的现象，未出现腐烂。

由图2 可知，对照组果实的腐烂指数始终高于臭氧处理组；在贮藏第6 天，对照组果实开始出现腐烂，而臭氧处理组果实腐烂指数为0，未出现腐烂；贮藏第9 天对照组的腐烂指数逐渐上升，臭氧处理组也开始出现腐烂；贮藏9～18 d，对照组腐烂指数显著高于臭氧处理组（P＜0.05）；结果表明，臭氧处理可显著抑制哈密瓜腐烂指数上升。

由图3 可知，臭氧处理组与对照组果实腐烂率逐渐上升，且贮藏过程中，对照组果实腐烂率始终高于臭氧处理组；臭氧处理组在贮藏第6 天腐烂率为0%，且从第6 天开始出现腐烂，随贮藏时间延长，腐烂率上升幅度较小；对照组果实腐烂率呈上升趋势，贮藏第3 天出现腐烂，随后不断上升，果实贮藏至6、9、12、15、18 d时，分别较臭氧处理组高30%、50%、60%、60%、90%，且存在显著差异性（P＜0.05）；由此说明，臭氧处理对哈密瓜果实腐烂率具有抑制作用。

2.2 臭氧处理对哈密瓜硬度的影响

臭氧处理对哈密瓜硬度的影响见图4。

图4 臭氧处理对哈密瓜硬度的影响Fig.4 Effect of ozone treatment on hardness of Hami melon fruit

哈密瓜果实硬度是衡量哈密瓜成熟度和贮藏品质的重要指标，硬度下降主要是由水分的减少和细胞壁中果胶物质的降解引起[10]。由图4 可以看出，随着贮藏时间的延长，两组哈密瓜在贮藏中期（6～9 d）、贮藏中后期（12～18 d）均呈快速下降的趋势。在贮藏初期，哈密瓜果实的硬度为5.82 kg/cm2，贮藏结束时，对照组和臭氧处理组果实的硬度分别为2.12 kg/cm2和2.83 kg/cm2，较贮藏初值分别下降了63.6%和51.3%，臭氧处理组的硬度极显著高于对照组（P＜0.01），表明臭氧处理可以有效延缓哈密瓜果实硬度的下降，减缓果实软化速度。

2.3 臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮原果胶含量的影响

臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮原果胶含量的影响见图5。

图5 臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮原果胶含量的影响Fig.5 Effect of ozone treatment on protopectin content of Hami melon fruit peel during storage

细胞壁物质结构是果实的重要组成部分，在果实成熟过程中能引起果实品质特性的变化，在一定程度上决定了果实的质地[11]；果胶主要存在于细胞壁的初生壁和中胶层中，对细胞壁结构的完整与稳定发挥至关重要的作用[12-13]。原果胶为非水溶性物质，含量越高，果实越坚挺。由图5 可知，随着贮藏时间的延长，两组果实的原果胶含量均呈下降的趋势，且臭氧处理组始终高于对照组，在贮藏前中期（0～9 d）两组果实原果胶含量均下降，且贮藏第9 天臭氧处理组极显著高于对照组（P＜0.01）；贮藏中后期（9～18 d）两组果实整体均呈缓慢上升的趋势，且贮藏12、15 d 臭氧处理组与对照组具有极显著性差异（P＜0.01）；在贮藏初期果实的原果胶含量为1.17%，贮藏结束时臭氧处理组与对照组较初始分别下降38.24%和42.68%，且贮藏18 d 时臭氧处理组与对照组具有显著性差异（P＜0.05）；由此说明，臭氧能够有效抑制原果胶含量的降解，防止果实软化。

2.4 臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮可溶性果胶含量的影响

臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮可溶性果胶含量的影响见图6。

果实软化最主要的原因是细胞壁结构被破坏，并随着果实成熟，细胞壁的网状结构不断被瓦解，在细胞壁降解代谢过程中，果实中的原果胶含量逐渐减少，而可溶性果胶含量逐渐增加[14-15]。由图6 可以看出，随着贮藏时间的延长，两组果实的可溶性果胶含量呈波浪上升的趋势，且对照组的可溶性果胶含量始终高于臭氧处理组；两组果实可溶性果胶含量在贮藏前中期（0～9 d）整体稳步上升，至贮藏后期（12～15 d）出现小幅度下降，且贮藏12、15 d 的对照组果实可溶性果胶含量显著高于臭氧处理组（P＜0.05）；该结果与硬度下降得到延缓的结果一致（图4），并与王伟等[16]得出的臭氧处理杏果实能够降低果实可溶性果胶含量，保持果实硬度的结果相似；由此说明，臭氧能够抑制可溶性果胶含量的增加，延缓果实软化。

2.5 臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的影响

臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮PG 活性的影响见图7。

在果蔬成熟软化过程中，果胶降解与细胞壁降解酶存在密切联系。多聚半乳糖醛酸酶主要通过作用于1，4-2-D-半乳糖苷键，使细胞壁发生解体，这可能是果实软化过程中果实品质发生变化的重要原因[17]。由图7 可知，两组哈密瓜果实的PG 酶活性在贮藏前期（0～6 d）活性较低，且贮藏6～9 d 对照组出现小幅度下降，臭氧处理组出现小幅度上升；对照组果实PG 酶活性从贮藏第9 天开始明显增强，且在贮藏第12 天出现高峰，为2 228 μg/（h·g）；贮藏末期（12～18 d），两组果实PG 酶活性逐渐下降，贮藏第12 天和第15 天对照组PG 酶活性较臭氧处理组分别高21.8%和39.3%，且对照组果实PG 酶活性显著高于臭氧处理组（P＜0.05）。由此说明，臭氧能够抑制果实PG 酶活性上升，延缓果胶分解速度，维持鲜果贮藏过程中的细胞壁结构。

2.6 臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性的影响

臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮β-Gal活性的影响见图8。

图8 臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮β-Gal 活性的影响Fig.8 Effect of ozone treatment on β-Gal activity of Hami melon fruit peel during storage

在果实成熟过程中，β-半乳糖苷酶（β-Gal）的活性易受到抑制，使细胞壁降解酶的活性随之升高，细胞壁降解酶与β-Gal 之间存在一定的相互作用关系[18]。由图8 可知，在整个贮藏期间，对照组果实β-Gal 活性始终高于臭氧处理组。贮藏前期（0～6 d）对照组果实β-Gal 活性逐渐增强，而臭氧处理组果实贮藏0～3 d 下降，随后贮藏第3 天后活性开始增强；随着贮藏时间延长，两组果实β-Gal 活性在贮藏6～18 d 处于平缓趋势，对照组贮藏6、9、12、15 d 的β-Gal 活性较处理组分别高0.39%、1.14%、0.92%、1.53%，且对照组在贮藏9～15 d 与臭氧处理组具有极显著差异（P＜0.01）；由此说明，臭氧能够抑制β-Gal 活性增强，达到延缓果实细胞壁分解速度的目的。

2.7 臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮纤维素酶（Cx）活性的影响

臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮Cx 活性的影响见图9。

图9 臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮Cx 活性的影响Fig.9 Effect of ozone treatment on Cx activity of Hami melon fruit peel during storage

纤维素是细胞壁的骨架物质，能催化纤维素分解为葡萄糖和半纤维素，加速细胞壁的解体过程，促使果实成熟软化[19]。Cx 可降解细胞壁中的纤维素，使细胞壁成分发生改变，进而影响果实的软化。由图9 可知，随着贮藏时间的延长，贮藏前期（0～6 d）对照组Cx 活性下降，臭氧处理组Cx 活性增强；贮藏6～12 d 臭氧处理组Cx 活性逐渐减弱，随后Cx 活性缓慢上升；而贮藏中后期（9～18 d）对照组Cx 活性整体升高，且贮藏9、12、15、18 d 较臭氧处理组分别高出19.1%、34.2%、22.9%、19.3%，具有极显著差异（P＜0.01）；与张晓睛[20]所得出的采用2.4 mg/m3臭氧处理蓝莓能够抑制Cx 酶活性，延缓果实软化的结果相似。由此说明，臭氧能够降低Cx活性，并降低果实纤维素降解速度，维持细胞壁结构。

2.8 臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮β-葡萄糖苷酶（β-Glu）活性的影响

臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮β-Glu活性的影响见图10。

图10 臭氧处理对哈密瓜果实采后贮藏期间果皮β-Glu 活性的影响Fig.10 Effect of ozone treatment on β-Glu activity of Hami melon fruit peel during storage

β-Glu 属于纤维素酶类，对果实细胞壁的降解与稳定产生重要影响[21]。由图10 可知，整个贮藏期间，对照组β-Glu 活性始终高于臭氧处理组；对照组β-Glu活性整体呈逐渐增强的趋势，而臭氧处理组β-Glu 活性变化波动较大；贮藏前期（0～6 d）臭氧处理组β-Glu活性较低，在贮藏第9 天和第15 天出现高峰，贮藏第9 天对照组β-Glu 活性较处理组高9.3%，贮藏后期（15～18 d）对照组β-Glu 活性逐渐降低。对照组β-Glu活性在贮藏3～12 d 极显著高于臭氧处理组（P＜0.01），由此说明，臭氧可以抑制β-Glu 活性的上升，延缓纤维素降解速度，保持果实细胞壁坚固，防止软化，该结论能够在果实硬度变化趋势得到证明。

3 结论

结果表明，臭氧能够抑制哈密瓜PG、β-Gal、Cx、β-Glu 与果实软化相关酶活性的上升，延缓原果胶的降解和果实硬度的下降，一定程度上抑制可溶性果胶含量的上升，从而抑制果实软化。结果表明，臭氧能够在一定程度上抑制细胞壁降解酶对果胶的降解，从而维持细胞壁坚挺，达到延缓软化的目的并延缓果实腐烂。