高效液相色谱法测定橘红枇杷片中柚皮苷的含量

张 燕

(楚雄技师学院，云南 楚雄 675000)

橘红枇杷片成份为化橘红、陈皮、枇杷叶、桔梗、紫苏子、甘草六味药材，采用现代制剂工艺技术精心研制而成，具有止咳嗽、祛除咳嗽时痰多的功效。橘红枇杷片收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》[1]中药成方制剂第四册(标准编号：WS3-B-0866-91)，无含量测定项。本文以柚皮苷为指标性成分，采用HPLC法测定控制橘红枇杷片含量，该法简便、快速、准确可靠。

1 仪器与试药

Agilent HP-1100型高效液相色谱仪(带四元泵，DAD检测器，自动进样装置，在线真空脱气设备，智能控制柱温箱及HP化学工作站)。

乙腈为色谱纯，所用水为二次重蒸馏水，其余试剂试药均为分析纯。

含量测定指标成分柚皮苷对照品购于中国药品生物制品检定所，供含量测定用(采用面积归一法，进行对照品纯度检查，纯度为100%)；橘红枇杷片为市售产品。

2 色谱条件

参考《中华人民共和国药典》2020年版一部化橘红项下柚皮苷的含量测定方法[2]，取柚皮苷对照品溶液进行紫外扫描，在 283 nm 处有最大吸收，故选择 283 nm 为检测波长。

Agilent ZORAX-C18色谱柱(φ4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈-0.1%磷酸 (体积比20∶80)为流动相；检测波长 283 nm；流动相流速设定为 1.0 mL/min，进样量为 10 μL[3]；色谱柱温度 25 ℃。

3 溶液的配制

3.1 对照品(柚皮苷)溶液的配制

取柚皮苷对照品，放入减压干燥器干燥至恒重，取适量，精密称定其质量，加入甲醇，配制成 55 μg/mL 的溶液作为对照品溶液。

3.2 样品溶液(橘红枇杷片)的配制

取待测样品(橘红枇杷片)10片，去除表面包裹的糖衣，放入研钵中，用研钵研成粉末。取样约 1 g，精密称定其质量，放入带玻璃塞的 100 mL 锥形瓶中，用移液管精密加入甲醇 25 mL，塞上玻璃塞，称定整个锥形瓶的质量，记录数据。把锥形瓶放入电热套中，调节合适的功率加热回流 1 h，取出放冷至室温，再次称定具塞锥形瓶质量。加入甲醇补足在加热回流过程中减失的质量，盖上玻璃塞，轻轻摇动锥形瓶使其混合均匀，用有机相微孔滤膜进行滤过，取续滤液作为样品溶液。

4 方法与结果

4.1 系统适用性

将对照品溶液与样品溶液按上述色谱条件进样。图1为对照品(柚皮苷)色谱图，图2为样品色谱图。结果显示，柚皮苷色谱峰的理论塔板数大于2000。

图1 对照品色谱图

图2 样品色谱图

4.2 提取方法的考察

取本品10片，除去糖衣，研细，制成2份样品。分别取约 1 g，精密称定其质量，放入带玻璃塞的锥形瓶中。用移液管精密加入甲醇 25 mL，塞上玻璃塞，称定整个锥形瓶的质量，记录数据。1份超声处理 60 min，1份加热回流提取 60 min[4]，取出放冷至室温，再次称定具塞锥形瓶质量。加入甲醇补足在加热回流过程中减失的质量，轻轻摇动锥形瓶使其混合均匀，用有机相微孔滤膜进行滤过，放入自动进样器进样测定，结果见表1。

表1 提取方法考察表

从表1看出，样品溶液选用加热回流提取方法进行处理，样品溶液中柚皮苷含量明显较采用超声提取方法进行样品处理的含量高，故选择回流提取对样品进行处理，同时根据检测结果确定样品取样量为 1 g。

4.3 线性关系

精密称取柚皮苷对照品适量，加甲醇分别制成7.237、 14.47、28.95、57.90、86.85、115.8 μg/mL 的溶液作为样品溶液。放置自动进样器上，设置进样量 10 μL，按确定的色谱条件进行检测，以柚皮苷对照品进样量为横坐标，对照品峰面积为纵坐标，得到标准曲线。统计学处理，得回归方程，Y=14.52x+3.98，r=0.99994，表明所用对照品柚皮苷在0.072～1.16 μg 范围内呈良好的线性关系。

4.4 精密度试验

取制备好的对照品溶液，按含量测定的方法连续进样6针 (进样量 10 μL)，以峰面积计算，RSD为0.50% (n=6)。

4.5 重复性试验

取同一批号样品照含量测定方法项下样品溶液的制备方法同时制成6份供试液，进样测定，以峰面积计算含量，RSD为0.85% (n=6)。

4.6 中间精密度试验

取样品，在同一试验室由不同人员按含量测定项下的方法试验，使用不同仪器进行含量测定，以峰面积计算含量，RSD为0.63% (n=6)。

4.7 稳定性试验

取样品照样品测定项下的方法制成样品溶液，按照上述色谱条件分别于0、4、8、12、24 h 进样检测，考察其稳定性，结果表明样品在 24 h 内稳定，RSD为0.62% (n=5)。

4.8 回收率试验

本试验采用加样回收法，精密称取柚皮苷对照品，加入适量甲醇溶解后，制备得到每 1 mL 含对照品柚皮苷 600 μg 的溶液。用移液管精密量取对照品溶液 1 mL，放置于六个锥形瓶中，蒸干；取已测知含量的样品，研细，取约 0.5 g，精密称定，分别称取6份样品，放入带有玻璃塞的锥形瓶中；按3.2项制得样品溶液后，分别放入液相色谱自动进样器上，进样测定，计算回收率，结果表明平均回收率为98.68%，RSD为0.77%(n=6)。详见表2。

表2 加样回收率试验结果(n=6)

4.9 阴性及空白对照试验

按照橘红枇杷片处方中各药材配比，除去化橘红药材，其余药材按制备工艺自配阴性样品，并按本文3.2项确定的样品溶液制备方法，进行阴性对照样品溶液的制备，进样检测，记录色谱图(图3为橘红枇杷片阴性对照色谱图，图4为空白对照色谱图)。结果表明阴性及空白无干扰。

图3 橘红枇杷片阴性对照色谱图

图4 空白对照色谱图

5 样品测定

取5批市售橘红枇杷，分别按上述方法操作。在上述色谱条件下，样品溶液与对照品溶液分别进样 10 μL，测定，记录色谱图。以外标法测定计算样品中有效成分(柚皮苷)的含量，结果见表3。

表3 橘红枇杷片中柚皮苷的含量测定结果(n=5)

6 结语

橘红枇杷片的现行质量标准依据的是《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第四册(质量标准编号：WS3-B-0866-91)，无含量测定项。化橘红是方中君药，始于明万历年间的《高州府志物产》。《本草拾遗》中记载，化痰止咳、风寒咳嗽为橘红的首要功效，无论寒咳或干咳，服用橘红均可见效。柚皮苷是化橘红中的指标性成分，用其控制橘红枇杷片质量合理可行。

本试验采用高效液相色谱法，能快速准确地测定橘红枇杷片中柚皮苷的含量，方法简便、可靠，为橘红枇杷片的质量监控和生产控制提供了保证。