露水草中β-蜕皮甾酮提取工艺优化及其体外抗氧化能力研究*

张彦昕，柴贝贝，石玉节，李海利

(1.郑州赛科药业科技有限公司，河南 郑州 450000；2.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450000)

露水草 (CyanotisarachnoideaC.B.Clark)又名珍珠露水草，一般指蛛丝毛蓝耳草，为鸭趾草科 (Commelinaceae)多年生宿根性草本，主要分布于印度、 越南等东南亚地区。 我国主要分布于大陆南部及台湾等地，生长于海拔 2700 m 以下的溪边、 山谷湿地或者湿润岩石上。 露水草通常每年八月下旬至十月下旬采收 (洗净，鲜用或晒干)，以全草入药，味甘、 性平，可用于治疗风湿痹痛、 虚热不退、 咽喉肿痛、 蛇虫咬伤等。

β-蜕皮甾酮(β-ecdysone)又称20-羟基蜕皮甾酮(20-Hydroxy ecdysterone)、露水草素，是露水草中主要活性物质之一，用于防治害虫及提高虾蟹产量。现代药理研究表明，β-蜕皮甾酮可以上调mRNA的合成速率，促进核酸和蛋白质的合成[1]；治疗风湿、关节炎[2]；调节糖代谢、促进脂类代谢[3]；免疫调节[4]；影响中枢神经系统[5]；促进分化人体表皮细胞，合成人体中胶原蛋白[6-7]；心血管保护作用；等等[8-9]。因此β-蜕皮甾酮广泛用于水产业、化妆品和医药行业，主要剂型有针剂、膏剂、片剂等。

近几年，学者或工业上对露水草的研究主要集中在生物活性及药理作用。本实验结合工业生产条件，优化提取工艺，利用HPLC测定最优工艺露水草提取物中β-蜕皮甾酮的含量，研究其体外抗氧化能力，为露水草的生产和开发利用提供参考。

1 试剂与仪器

露水草(云南)，经河南牧业经济学院付运星鉴定为鸭趾草科露水草干燥根茎。β-蜕皮甾酮标准品(北京普天同创生物科技有限公司)、屈臣氏蒸馏水、 乙醇(分析纯)、甲醇、乙腈(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)。

电子天平(Quintix125d-1CN)，油浴磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)，旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限公司)，恒温水浴锅(上海树立仪器仪表有限公司 DZKW-C)，高效液相色谱仪(安捷伦1260 美国)，时间分辨荧光酶标仪(TECAN)。

ABTS试剂盒和DPPH试剂盒，均采购于南京建成生物工程研究所。

2 研究方法

2.1 样品前处理

取适量干燥露水草根，为适应生产型企业的提取方式，只剪碎露水草根，备用。

2.2 提取工艺研究

2.2.1 温浸提取

参考传统工厂生产提取露水草的工艺，本研究选择 60、80、100 ℃ 温浸提取，料液比1 g∶20 mL，共提取两次，2 h/次，提取时用保鲜膜封住瓶口，考察温度对β-蜕皮甾酮的提取影响。提取续滤液合并浓缩，加入85%乙醇进行醇沉 12 h，取醇沉上清液真空浓缩至干，得到干燥提取物，避光保存。

2.2.2 加热回流提取

回流提取通过加热和冷却来分离有效成分，可以大大增加提取率。 本研究分别考察了 60、 80、 100 ℃ 回流提取，料液比1 g∶20 mL，共提取两次，2 h/次。 提取续滤液合并浓缩，加入85%乙醇进行醇沉 12 h，取醇沉上清液真空浓缩至干，得到干燥提取物，避光保存。

2.3 高效液相检测

2.3.1 标准对照品溶液配制

精密称定β-蜕皮甾酮 0.00100 g 于 10 mL 棕色容量瓶，甲醇定容刻度，得质量浓度为 0.100 mg/mL 的标准储备液。

2.3.2 供试品溶液配制

精密称定各个样品的干燥提取物至 10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到样品溶液，每个样品检测三次。为方便记录，对样品进行编号，如表1所示。

表1 提取物样品及编号

2.3.3 仪器色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(φ4.6 mm×250 mm，5 μm)；色谱条件：V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=28∶14∶58，等度洗脱 15 min，柱温30±2 ℃，波长 243 nm，流速 1.0 mL/min，进样量 10 μL。

2.4 体外抗氧化研究

1)DPPH法检测露水草提取物的抗氧化能力。根据待测样品及标准品的数量，配制适当的 200 μmoL/L DPPH 储备液。同时用无水乙醇配置不同质量浓度的Y6样品溶液和 Trolox标准溶液(终质量浓度分别为 0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mg/mL)。每个样品分别设置3个复孔，并在空白对照孔、标准曲线孔和样品孔中分别加入 20 μL 无水乙醇溶液、不同质量浓度的Trolox标准溶液和样品溶液，随后在每孔加入 180 μL DPPH储备液，室温静置孵育 30 min 后，测定其在λ=517 nm 处的吸光度。

DPPH 自由基清除率=[(A0-A1)/A0]×100%。其中，Y6样品及标准品的吸光度值记为A1；空白对照孔的吸光度值记为A0。

2)ABTS法检测露水草提取物的抗氧化能力。ABTS溶液和氧化剂溶液体积比1∶1配制适量的ABTS工作母液，避光放置 16 h 后，使用80%乙醇将其稀释成ABTS工作液，同时配置不同浓度的样品溶液和Trolox标准溶液 (终质量浓度分别为 0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL)。每个样品设置3个复孔，空白对照孔、标准曲线孔和样品孔中分别加入 10 μL 80%乙醇溶液、不同质量浓度的Trolox标准溶液和样品溶液。每孔加入适量ABTS工作液，室温静置孵育 5 min，测定其在λ=405 nm 处的吸光度。

ABTS自由基清除率=[(A0-A1)/A0]×100%。其中，Y6样品及标准品的吸光度值记为A1；空白对照孔的吸光度值记为A0。

3 研究结果

3.1 提取方式的选择

根据峰面积，计算不同提取方式下β-蜕皮甾酮的含量。由表2可知，选择加热回流提取的含量高于温浸提取的。

表2 各样品出峰时间、峰面积及 β-蜕皮甾酮含量

3.2 提取温度的选择

根据峰面积，计算不同提取温度下β-蜕皮甾酮的含量。由表2可知，100 ℃ 温度提取时有效物质含量最高。

3.3 高效液相色谱方法学验证结果

1)专属性考察结果。取对照品溶液、Y6样品，按上述方法制备供试品溶液、阴性对照品溶液。按照2.3色谱条件下进样，每针进样三次，记录色谱图(图1)。由图1可知，阴性对照品色谱在对照品出峰位置上无干扰峰，即本实验条件下对测定干扰较小，系统误差较小。

(a)阴性对照色谱图

(c)样品色谱图

2)精密度考察结果。取Y6样品，按上述方法制备供试品溶液。在2.3色谱条件下，连续进样7次，记录并分析色谱峰，如表3所示。由表3可知，每次进样色谱峰相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积的RSD均小于3%，表明仪器的精密度良好。

表3 精密度测定结果

3)重复性考察结果。取Y6样品，按上述方法制备供试品溶液7份。在2.3色谱条件下进样，记录并分析色谱峰，如表4所示。由表4看出，每次进样色谱峰相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积的RSD均小于3%，表明该方法的重复性良好。

表4 重复性测定结果

4)稳定性考察结果。取Y6样品，按上述方法制备供试品溶液。在2.3项色谱条件下，在制备后分别于 0、2、4、8、12、24 h、48 h 时进样，记录分析色谱峰，如表5所示。由表5看出，每次进样色谱峰相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积的RSD均小于3%，表明样品的稳定性良好。

表5 稳定性测定结果

5)线性考察结果。 取标准储备液精密稀释至质量浓度为 0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125 mg/mL 的标准溶液，吸取上述质量浓度标准溶液与 0.1 mg/mL 的标准溶液各 10 μL 进样，每个质量浓度重复进样三次，结果见图2。

图2 β-蜕皮甾酮标准曲线

6)加标回收率考察结果。精密称取已知含量的Y6样品6份(每份0.0010 g)，再分别精密加入对照品溶液，标准品含量为样品含量的80%、100%、120%，超声混匀，滤过。按2.3色谱条件测定，每份进样3次，结果见表6。

表6 加标回收率测定结果

3.4 体外抗氧化结果

如图3所示，露水草提取物对于DPPH自由基的清除能力随着质量浓度升高而增加，当样品质量浓度达到 0.8 mg/mL 以上时，抗氧化能力趋于稳定，此时对DPPH自由基的清除率达到85%；同样，ABTS抗氧化能力检测结果显示，露水草提取物对ABTS的自由基也表现出较好的清除能力，为95%左右。

(a)DPPH自由基清除结果图

(b)ABTS自由基清除结果图

4 结论

露水草在各行业中应用广泛，但对其提取工艺研究的不多。为结合工业化生产与利用，本研究在单因素实验基础上，考察了露水草中β-蜕皮甾酮的最优提取方式。在以水为溶剂，100 ℃ 加热回流提取条件下，β-蜕皮甾酮的质量分数可达到28%左右。在本实验建立完整的液相检测条件下，标准曲线相关系数达到0.9999，精密度、重复性、稳定性、加标回收率的RSD均小于2%。通过体外抗氧化实验得出，露水草提取物可以有效清除自由基，为露水草以后的应用提供参考。