食品级微生物发酵中药研究进展

郑嘉馨，张 建，蒋倍娴，章玉丽，胡锦余，赵 廷

(浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100)

在近年新冠(COVID-19)疫情的防控和救治中，中医药发挥了巨大作用[1]，如参黄颗粒综合治疗危重症和重症COVID-19[2]、中医药调控肠道菌群防治COVID-19[3]、国家卫生委员会批准的“三味中药三方”治疗COVID-19[4]，再次将中药推向医疗前沿。

食品级微生物发酵中药历史悠久。三千年前周朝《尚书•说命》中记载：“若做酒醴，尔维曲蘖”[5]；东汉时期张仲景的《金匮要略》中记载神曲是由新鲜青篙、苍耳等发酵而成，“行脾胃滞气，散腑风冷”[6]。传统中药加工常采用蒸、煮、炒、熬等方法，这些方法加工深度不足，使中药有效物质难以得到充分利用[7]。传统的中药发酵技术存在菌种和发酵环境不可控，以及菌种筛选技术落后、发酵过程调控参数不稳定、发酵机理不明确、量效评价较主观等问题。因此，近年来研究人员将微生态学、发酵工程技术、组学分析技术等现代生物技术与中药传统发酵技术有机结合，以建立相对可控、智能化的现代中药发酵技术[6]。本文对食品级微生物在中药发酵中的应用及技术开发研究进行综述，为运用食品级微生物发酵中药提供参考。

1 食品级微生物发酵中药技术

1.1 菌种

中药多采用单一菌种发酵，也有多菌种混合发酵。单菌种发酵具有定向分解某种有效成分并提高其效价的特点，同时可以修饰毒性结构达到脱毒目的。因此，国内外学者常采用单一的菌种对中药进行定向催化和改造[5]，如：布拉氏酵母菌Saccharomyces cerevisiaevar.boulardii发酵山药[8]、乳酸菌发酵枸杞[8]、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis发酵黄芪[9]、黑曲霉发酵荞麦[10]等。多菌种混合发酵较复杂，多种酶系互相增益，使中药生物转化率提高[5]。药用真菌和益生菌的组合已成为中药微生物发酵菌种的主流[9]。研究发现，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum与安琪甜酒曲混合发酵薏米比甜酒曲单菌种发酵的酒精度、总酸、氨基酸态氮含量分别提高9.5%、328.81%和51.61%，同时抗氧化活性增强，DPPH 和ABTS 自由基清除率分别从67.03%和52.36%提升至76.22%和63.16%[8]。且通过共育模式的人参皂苷总产量和次要人参皂苷产量明显提高[10]。

用于中药发酵的菌有：细菌、真菌、药食两用菌等。发酵细菌具有结构简单、发酵形式多样、代谢产物丰富、敏感、易改良的特点；发酵真菌具有种类丰富、培养环境简单、次生代谢产物丰富、能产生具较强分解作用酶的特点，是中药发酵的重要菌种。药食两用菌，顾名思义就是可用于养生、食疗的菌，很多本身用作中药，具有药性平和、不良反应较少等特点。发酵菌的代表菌种及其应用领域见表1。

1.2 发酵类型

现代发酵技术按发酵形式可分为固态发酵、液态发酵和双向发酵。固态发酵历史悠久，操作简单、成本低，不需严格的无菌环境，但发酵速度慢；液态发酵的工艺要求较高，进行工业化大规模液体发酵培养时多数中药易被杂菌污染，需做好灭菌工作；双向发酵是以药用真菌为发酵菌种，中药或药渣为菌生长提供营养，并产生各种酶分解转化营养，生成药性菌质体(图1)，它具有发酵组合多、生产条件可控、可工业化大规模生产、前景好的优点，但也存在不同组合机理不明，缺乏科学的理论依据等问题，如红曲霉–金钗石斛[20]，故双向发酵技术仍需进一步研究。

表 1 食品级微生物发酵中药应用实例Table 1 Application of food-grade microbial fermentation of traditional Chinese medicine

图 1 双向发酵技术Fig.1 Bidirectional fermentation diagram

2 食品级微生物发酵中药机理及作用

中药经食品级微生物发酵能产生多种酶(纤维素酶、果胶酶等)，使其有效成分尽可能完全释放，或产生新的活性成分，药效增强，且毒副作用降低。发酵过程产生的代谢产物和药效成分协同增效产生高级醇等，改善口感。发酵还可能产生次级代谢产物，如抗生素等。此外，利用药渣发酵还具有节约药材、保护环境的作用。

2.1 有效成分提取率提高及药效增强

中药原料多为植物，其药理活性成分分布在细胞内，而胞内的纤维和胶质使药效成分不易释放。但食品级微生物中的多种酶可降解中药细胞壁组分，使药效成分释放，从而使有效成分提取率和药效加大。有研究比较不同菌种对降解烟梗细胞壁组分(果胶、纤维素、半纤维素和木质素)的影响发现，乳酸菌降解纤维素效果最好，使其质量分数从20.83%降至15.90%；芽孢杆菌分解木质素和半纤维素效果明显，使其质量分数分别从10.91%和10.66%降至5.55%和7.40%；发酵4 d 后，鼠李糖乳杆菌降解果胶效果最好，果胶降解率可达87.75%[28]。

发酵的菌株及其代谢产物与药物可发生协同增效，如红曲菌发酵黄精，提升了降血脂的功能[29]；金钗石斛与红曲霉联合发酵，比单独红曲霉发酵代谢产物的抗氧化性或金钗石斛的抗氧化性均有不同程度的提高[20]；陈皮、山楂和白芷联合补充剂与糯米混合，莫纳可林K 含量比不加药的高41.18%[30]。

2.2 改善口感

一些具有强大药效的中药因口感不佳制约了其推广应用，而食品级微生物发酵可改善口感。中药发酵产生多种高级醇、具香味酯、有机酸等风味成分，使产品口感和风味均有提升[28,30]。如红曲菌发酵黄精，改善了生黄精口感上的麻味及对咽喉的刺激性；乳酸菌发酵枸杞，使醛还原或氧化为醇或酸，从而使酯类产量增加，达到去除枸杞汁的异味、丰富风味的效果，发酵后枸杞汁的活菌数均在107CFU·mL–1以上。枸杞汁经乳酸菌发酵处理能显著提高生物活性物质含量，特别是副干酪乳杆菌Lactobacillusparacasei。此外，发酵还导致枸杞汁酚类物质积累明显增加，并产生68 种挥发性化合物，其中包括20 种醇类物质、18 种酯类物质、10 种脂肪酸和10 种脂肪酸。值得注意的是，发酵后醛类物质含量显著降低，而酯类物质含量显著增加，表明乳酸菌可用于降低枸杞汁的腥味，提升口感[31]。薄荷汁发酵前后比较显示，各部分发酵液香气有所下降，但发酵后薄荷汁更为缓和，冲击力较低，消费者接受度更高，且甜味均较为明显。发酵处理的薄荷根、茎、叶总酚和总黄酮含量显著提高；感官评价表明，仅叶部和根茎部位颜色差异显著，这为开发薄荷的发酵功能性产品提供了新思路[11]。

2.3 产生新的活性成分

食品级微生物生长代谢可分泌蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、半纤维素酶、纤维素酶等数十种胞外酶，这些酶使特定药效分子基团发生羟化、脱氧、磷酸化等反应，进而修饰中药成分结构，产生新的活性成分。使用嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌发酵鬼针草茎、叶，其总黄酮中某些成分发生生物转化[32]；灵芝子实体水提取物与嗜酸乳杆菌和短双歧杆菌体外发酵，主要灵芝酸成分结构发生变化，例如灵芝酸A(GA)转变为灵芝酸C，促进其免疫刺激活性[13]。植物乳杆菌MG5276发酵黄芪，发酵前未检出的毛蕊异黄酮和芒柄花素在发酵后能检出[33]；川芎嗪是中药川芎的有效成分，液质色谱分析川芎发现川芎嗪含量低于检测限(0.1 ng·mL–1)，而枯草芽孢杆菌LB5 发酵后川芎嗪产量为1.0268 mg·mL–1。初步研究表明，川芎嗪是枯草芽孢杆菌LB5 通过分泌蛋白代谢，消耗川芎中的糖产生的，而非川芎本身的次生代谢产物[34]。

2.4 毒副作用降低

一些中药具有较强的生物活性，同时毒副作用也较大，经食品级微生物发酵后，产生的系列酶将中药所含大分子有毒物质(如生物碱)分解和转化，使其毒性降低或消除。醋炙法及煎汤(分别以金钱草、绿豆、白芍、甘草各自煎汤)炒炙法制备的雷公藤炮制品均能使被雷公藤生品降低的小鼠血清睾酮水平显著逆转69.9%、122.4%、75.2%、101.4%、106.6%，说明以上炮制对雷公藤诱导的小鼠生殖毒性均具有减毒作用[35]。灵芝双向发酵雷公藤，并对发酵产生的灵雷菌质进行分析发现接种量10 mL·100 mL–1、发酵30 d 得到的灵雷菌质(N2-G30)在3.75 μg·mL–1质量浓度下表现出减毒持效的作用，相比于雷公藤，可抑制脂多糖诱导的小鼠RAW264.7 细胞释放促炎因子TNF-α 和IL-6，并减轻对人正常肝细胞增殖的抑制作用。通过液相色谱-质谱联用分析雷公藤发酵前后的主要成分含量变化，结果显示，与发酵前相比，发酵后雷公藤甲素、雷公藤红素、雷酚内酯含量增加，雷公藤内酯甲含量降低，这些成分的含量变化与N2-G30 的减毒持效作用有关[36]。

2.5 节约药材，保护环境

中药生产中的药渣主要成分为纤维素、半纤维素及未提取完全的有效成分、无机元素等，一般通过填埋、燃烧等方式处理，这样既造成资源浪费和环境破坏。药渣经食品级微生物发酵可降解纤维素、半纤维素等，使中药材的利用率大大提高，降本增效，并缓解药渣对环境造成的破坏。青蒿药渣经固态发酵后，可作为中药饲料添加剂[37]。以中药残渣水解物为底物发酵生产细菌纤维素，利用木糖驹形氏杆菌Taonellamepensis合成细菌纤维素，细菌纤维素产量最高达0.866 g·L–1[38]。研究发现，以厚朴药渣为原料，接种黄孢原毛平革菌Phaner-ochaete chrysosporium进行固相发酵，可利用酶解厚朴药渣中的木质素，提高药渣中铜离子的去除率，以实现中药药渣的资源化利用。随着木质素酶活性的提高，发酵改性后的厚朴渣的铜离子去除率显著提高，且在第14 天达最大值，是初始值的3.15 倍[39]。

3 食品级微生物发酵中药的应用

3.1 医疗保健领域

饮食性肥胖与脂代谢、糖代谢和胆固醇代谢紊乱，以及氧化应激、内质网应激、肠道微生物群异常和慢性低度炎症等密切相关[40]。以总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平评估益生菌干预的效果，发现益生菌有缓解超重或肥胖成年人血脂异常的潜力[41]。从发酵处理的高脂饲料喂食的肥胖大鼠中取得的脂肪组织质量显著降低，肥胖相关的生物标志物(总胆固醇、促炎细胞因子等)大大减少，说明发酵物可以调节脂肪生成、脂质代谢、微生物群等，使之具有强大的抗肥胖潜力，为控制肥胖和研发肥胖相关代谢紊乱的新型治疗剂提供了可能[42]。

在调节肠道健康方面，乳杆菌发酵人参对大鼠肠道菌群、免疫力、抗生素相关性腹泻产生积极影响[43]。通过对体外发酵气体、短链脂肪酸、pH 和菌群丰度的评价，表明灵芝寡糖对肠道菌群具有良好的调节作用[4]。细菌培养试验表明，植物乳杆菌发酵中药均能降低小鼠腹泻指数，恢复肠道菌群，显示出比中医药或联合植物乳杆菌更大的优势[44]。

在灭菌消炎方面，食品级微生物可调节口腔微生物生态，重建“健康”微生物组[45]，如益生菌辅助剂可减少牙周病原菌种，且使牙周组织和深牙周袋内危害大的病原菌数量减少[46]；通过肠黏膜屏障受损模型小鼠实验对发酵液进行分析，结果表明，枯草芽孢杆菌发酵灵芝改善了肠道菌群失调，炎症得到缓解，结肠损伤减轻[47]；发酵枸杞通过发挥抗炎和抗氧化的作用，改善高脂喂养大鼠肝脏功能及其脂质代谢[48]。从九味抗炎药发酵混合物中分离出一种新型酒精酸盐，具有降低小鼠炎症因子TNF-α和IL-1β 表达的作用[49]。

在抗氧化、抗肿瘤方面，新型益生菌发酵山楂葛根较传统山楂葛根配方具有更高的活性成分浓度和抗氧化活性，对心血管疾病患者有一定的健康益处[50]。乳酸乳球菌KC24 发酵水培人参，其抗氧化性增加且可作为具有抗炎作用的功能性材料应用于功能性食品和医药行业[51]。与天然冬虫夏草相比，发酵虫草菌粉富含蛋白质、多肽、甾体化合物、核苷类衍生物、多糖类等活性成分，可明显增强机体对肿瘤细胞的抑制作用[52]。桑黄通过液体发酵，其生物活性物质桑黄总三萜提取物具有抗菌和抗肿瘤活性，有助于筛选新型真菌衍生的抗癌和抗菌化合物[53]。研究发现，枯草芽孢杆菌发酵的胡枝子可作为白血病和肺癌的潜在治疗药物[16]。目前，中药发酵的研制大多处于开发阶段，临床及工业化生产应用还有待进一步发展，大宗中药发酵产品的开发具有较大发展空间。

3.2 化妆品行业

目前食品级微生物发酵中药应用于化妆品的主要功能为祛痘、抗氧化、抗衰老。采用酵母、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、混合菌发酵铁皮石斛，其活性成分、抗氧化活性、酪氨酸酶抑制率和紫外线B 吸收等指标均优于非发酵组，说明发酵中药具有作为功能性化妆品原料的潜力[54]。通过丝状真菌斜卧青霉Penicilliumdecumbens酵黄芩提取物4 d，发现91.0%汉黄芩苷被转化为汉黄芩素，提取物的抗痤疮活性增强，可应用于抗痤疮化妆品开发[55]。临床研究表明，使用 1% 发酵黑参的乳膏配方可显著减少眼部皱纹，提亮肤色，适用于抗皱、焕采化妆品开发[56]。乳酸菌和双歧杆菌发酵富硒绿豆，形成富含多酚、多肽和γ-氨基丁酸的发酵液，可明显清除自由基、抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素合成、上调水通道蛋白3 的表达，可应用于抗氧化、美白、保湿化妆品开发[57]。曲霉固态发酵三七的抗氧化和抗衰老的标志代谢物原人参二醇(PPD)和原人参三醇(PPT)含量在4 d 发酵期内倍增，同时PPD 和PPT 显著改善了人真皮层纤维细胞中 I 型胶原蛋白、原纤维蛋白-1 和弹性蛋白的表达，可应用于抗氧化、抗衰老化妆品开发[58]。近年来，随着天然有效活性成分产品的不断开发，以及追求健康美容的观念深入人心，发酵型中药也在不断进入美容行业并占领高端市场。

3.3 农业养殖领域

中药渣固态发酵产生大量的酶、活性肽、寡糖、有机酸等生物活性成分，可对动物肠道菌群起有利调节作用，增强畜禽抗病能力和促进生长发育等，在农业养殖领域具有突出的应用价值[59]。随着超级病菌的出现，抗生素的滥用问题引起全球人民关注，我国自2020年7月1日起，停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。因此，发酵中药或可代替抗生素应用于养殖业。添加解淀粉芽孢杆菌DSM25840 或枯草芽孢杆菌DSM25841 对仔猪生长、健康、免疫、肠道功能和微生物谱有积极影响，可减少断奶仔猪产肠毒素大肠杆菌的感染，减少腹泻和影响黏膜转录组谱[60]。在蛋鸡日粮中添加3‰植物乳杆菌发酵黄芪，能明显提高蛋鸡的产蛋率、抗氧化能力、免疫状态、肠道微生物群丰度，且对卵子质量基本无影响[61]。健康鸡粉及其发酵产物对肉鸡前肠微生物群落具有调节作用[62]。在饲料中添加益生菌和中药多糖能改善羔羊生长性能、血液指标、瘤胃发酵和细菌组成，与对照相比，益生菌处理提高了羔羊体内血糖和免疫球蛋白G 浓度，增加瘤胃微生物蛋白含量但瘤胃液pH 下降[63]。由此可见，可食用菌发酵中药添加至家禽饲料中，对家禽疾病预防有一定的作用，可在一定程度上代替兽药，减轻过度使用抗生素的负面影响。

4 展望

传统的单一菌种对单一中药发酵具有局限性，目前已开展中药多菌种发酵的研究。未来在中药发酵研制中，应将人工智能、大数据与生物技术相结合，运用高效低耗的低温干燥等技术，通过互联网和人工智能实现量化、直观化观察发酵过程，对微生物代谢网络进行解析，以明确发酵机理；同时利用人工智能深度学习等智能技术对重要发酵微生物群落进行科学设计，实现工业智能化发酵；通过高通量筛选技术解析微生物群落结构，选育优良菌种；建立和完善中药发酵质量评价体系。食品级微生物发酵中药具有广阔前景，可在医疗保健、化妆品、畜牧业等领域进行深层次开发。