靶向端粒酶逆转录酶基因siRNA抑制兔早期后发性白内障的实验研究△

张翔翔 何娜 何佳玲 吕志刚

（浙江大学医学院附属金华医院 金华市中心医院眼科 金华 321000）

后发性白内障(posterior capsule opacification，PCO)，又称后囊膜混浊，是白内障术后一种主要的远期并发症。目前，国内外预防PCO 发生的研究主要是通过提高手术技术、优化人工晶状体设计及药理学方法等[1-2]，但这些方法都无法安全、有效地预防远期PCO。我们前期研究[3]发现，在兔后囊膜混浊晶状体上皮细胞中存在端粒酶活性，端粒酶的激活使端粒长度不断延长，细胞获得无限增殖的能力。通过抑制端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)活性降低端粒酶活性，可以抑制端粒长度的延长[4]。我们提出假说：以端粒酶活性高度相关的催化亚基TERT 作为靶点，通过小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转染，降低晶状体上皮细胞端粒酶活性，能够抑制PCO 的发生。为观察靶向TERT 基因siRNA 对PCO 的抑制作用，初步探讨靶向TERT 基因siRNA 眼内应用的安全性及有效性，我们进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

普通级健康新西兰大白兔20只[采购于杭州余杭科联兔业专业合作社，许可证号：SCXK(浙)2017-0004]，3～4 月龄，雌雄不限，体重2.2～2.5 kg，实验前未经任何处理，眼部检查无异常。所有动物在实验前适应性饲养2 周，分笼饲养，自由进食及饮水，保持动物房室温(25±2)℃，通风良好。

1.1.2 实验试剂与仪器

靶向TERT 基因siRNA 重组腺病毒(TERT-siRNAAdv)( 苏州吉玛基因股份有限公司)，序列为GCTGTTCAGCGTGCTCAATTA；戊巴比妥钠、注射用苯巴比妥钠(福建闽东力捷迅药业)；医用透明质酸钠凝胶，0.5 mL/支(上海齐胜生物制剂有限公司)；妥布霉素地塞米松滴眼液(Alcon 公司，美国)；手术显微器械(江苏明仁医美器械)；手术显微镜、眼前段照相仪(北京天诺翔科学仪器有限公司)；超声乳化仪(pulsar，Optikon 公司，意大利)；手持裂隙灯显微镜(PSL Classic，keeler 公司，英国)；手持眼压计(PRO，icare 公司，芬兰)。

1.2 实验动物分组

将20 只新西兰大白兔采用自身对照方法，分为2 组，其中以右眼作为TERT-siRNA-Adv 组(实验组)，左眼作为阴性对照腺病毒Adv 组(对照组)，每组20 眼。

1.3 实验方法

由同一位经验丰富的医师完成所有实验动物所有眼别的手术。术前复方托吡卡胺滴眼液滴眼3 次，苯巴比妥钠(1 mL/kg)+戊巴比妥钠(12.5 mg/kg)经兔耳缘静脉进行注射麻醉，行角膜切口后环形撕囊，直径约5 mm，水分层，超声乳化吸除晶状体，角膜切口缝合1 针。术毕实验组前房内注入滴度为109PFU/mL 的TERT-siRNA-Adv 0.1 mL，对照组前房内注入滴度为109PFU/mL 的阴性对照Adv 0.1 mL。术后使用妥布霉素地塞米松滴眼液滴眼(每天4 次)，复方托吡卡胺滴眼液滴眼(每天2 次)，均使用2 周。

1.4 观察指标

1.4.1 常规检查

分别于术前，术后第1 天、1 周、2 周、4 周，用手持眼压计行眼压检查，测量实验组和对照组的眼压；用手持裂隙灯显微镜观察实验组和对照组角膜水肿、前房闪辉的情况。角膜水肿分级[5]：0 级为角膜透明；1 级为角膜薄雾状水肿，内皮面光滑，虹膜纹理尚清晰；2 级为角膜浅灰色水肿，内皮面粗糙，虹膜纹理模糊；3 级为角膜弥漫性灰白色水肿，内皮面龟裂状，虹膜纹理视不清；4 级为角膜乳白色，眼内结构看不清。前房闪辉分级[6]：0 级为前房无闪辉；l 级为微弱的前房闪辉；2 级为中等程度前房闪辉，虹膜纹理可以辨别；3 级为虹膜纹理和晶状体轮廓难以辨认；4 级为眼内结构不可辩，房水呈凝固状态，伴有大量纤维素性渗出。

1.4.2 后囊膜混浊检查

落实建筑行业项目管理机制，综合考虑项目登记的建筑业工程，能够准确掌握建筑项目的进度，并对项目本身的申报纳税状况以及开具发票的情况进行有效监控。但是，增值税管理模式是将纳税人作为主体，综合考虑机构所在区域的纳税基本原则，而所在区域的国税机关要负责构建相应的监控机制。但这种方式已经远远超出了现阶段增值税管理的范围，直接增加了税务机关的工作难度，很难对异地工程项目信息进行有效掌握，进而引发了虚开发票或增加了税源流失风险，直接制约了建筑行业税收征管工作的开展。

于术后第1 周、2 周、3 周及4 周用手持裂隙灯显微镜观察实验组和对照组的后囊膜混浊情况，于术后第4 周用眼前段照相仪行后囊膜照相，观察并评价后囊膜混浊分级情况。后囊膜混浊分级标准[7]：0 级为后囊膜无混浊；1 级为后囊膜轻度混浊并眼底可看清；2 级为中度混浊并眼底仅可看清部分结构；3 级为重度混浊且无法看清眼底。

1.4.3 眼内组织病理检查

术后第4 周空气栓塞法处死兔子，摘取术眼用4%甲醛溶液固定3～5 d，经梯度乙醇脱水，二甲苯清洗，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、蒸馏水各15 min，苏木精染色5 min，自来水冲洗，1%盐酸乙醇分化30 s，自来水浸泡15 min，置伊红液3～5 min，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜下观察角膜、后囊膜、虹膜的各层组织结构情况。

1.4.4 Western blot 法检测

术后第4 周空气栓塞法处死兔子，获取后囊膜组织，磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液洗涤3 次，制取小片标本，加入含有PMSF 的RIPA 裂解液200 μL，10 000 转/ min，离心5 min。收集上清液，BCA 法测定蛋白浓度后，加入SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，煮沸10 min，分装于EP 管中。每个样品通过SDSPAGE 分离并转移到PVDF 膜，在室温下将膜在5%脱脂牛奶中封闭2 h，添加一抗后在4 ℃下孵育过夜，添加二抗后在室温下孵育2 h。使用ECL 试剂盒测定免疫反应性，并用ChemiDoc XRS 系统测定蛋白条带灰度值。

1.5 统计学处理

所有数据采用SPSS 19.0 软件统计。计量数据以均数±标准差()表示，采用重复测量两因素方差分析对手术前后同组数据进行比较，采用独立样本t检验对2 组组间数据进行比较；等级资料采用秩和检验进行比较；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 眼压及眼前段反应情况

2.1.1 眼压

2组兔子术前眼压：实验组为(11.70±2.23)mmHg，对照组为(11.96±1.97)mmHg，2 组间术前眼压比较差异无统计学意义(t=-0.391，P=0.698)。实验组术后眼压：术后第1 天为(19.28±5.38)mmHg，术后第1 周为(13.72±4.56)mmHg，术后第4 周为(12.14±3.94)mmHg，对照组同期眼压为(18.83±3.36)、(12.62±4.53)及(12.17±3.29)mmHg，术后同期2 组间眼压比较差异均无统计学意义(t=0.321，P=0.750；t=0.762，P=0.451；t=-0.026，P=0.979)。2 组组内比较：术后第1 天眼压均升高，与术前眼压比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而术后第1 周眼压较术前眼压均偏高，但差异均无统计学意义(P＞0.05)。

实验组与对照组术后均出现不同程度的角膜水肿。2 组均在术后第1 天角膜水肿最明显，分级最高达3 级，未见4 级角膜水肿表现。随着时间延长，2 组角膜水肿均逐渐减轻，至术后第1 周，大部分角膜恢复透明。2 组间角膜水肿分级比较差异无统计学意义(表1)。

表1 2组术后角膜水肿分级比较

2.1.3 前房闪辉分级

实验组与对照组术后均出现不同程度的前房闪辉，分级最高达4 级。随着时间延长，2 组前房闪辉均逐渐减轻，至术后第1 周，大部分兔子的前房闪辉均消失。2 组间前房闪辉分级比较差异无统计学意义(表2)。

表2 2组术后前房闪辉分级比较

2.1.4 PCO 分级

术后扩瞳后手持裂隙灯观察实验组与对照组后囊膜混浊情况，并用眼前段照相仪行后囊膜照相。2组后囊膜于术后第2 周开始出现轻微混浊，无明显机化情况，眼底观察清晰(图1A)。术后第4 周，2组后囊膜出现不同程度增殖样改变，实验组PCO 程度分布于1 级和2 级(图1B 和C)，而对照组多分布于2 级和3 级(图1C 和D)，对照组PCO 程度重于实验组，差异有统计学意义(表4)。

图1 2 组术后第4 周PCO 不同分级表现 A.PCO 0 级：后囊膜中央区透明，周边散在增殖；B.PCO 1 级：中央区散在增殖，周边条带状增殖；C.PCO 2 级：后囊膜中央区多处条带状增殖；D.PCO 3 级：中央区大片状增殖灶。

表4 2 组术后第4 周PCO 分级比较

2.1.5 术后眼内组织病理学检查

术后第4 周眼内各组织病理检查，光镜下见实验组后囊膜下的上皮细胞分布均匀，排列规整，无明显或少量成纤维细胞增殖(图2A)；对照组后囊膜细胞增生反应明显，多层成纤维细胞增殖，排列紧密，囊膜结构紊乱(图2B)。试验组与对照组的角膜、虹膜各层组织结构完整，细胞排列整齐，未见明显水肿，未见明显炎性细胞浸润(图2C～F)。

2.1.6 Western 印迹法检测α-SMA 表达

Western 印迹法检测可见，与对照组比较，实验组后囊膜细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达条带明显变细，表达强度明显减弱(图3)；实验组α-SMA 蛋白相对表达量明显减少，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05，图4)。

图3 Western 印迹法检测的细胞中α-SMA 蛋白表达 α-SMA为α-平滑肌肌动蛋白；α-Tubulin 为α-微管蛋白。

图4 2 组后囊膜细胞中蛋白相对表达量比较 与对照组比较，*示差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

近十余年来，随着我国人口老龄化，接受白内障手术的人数逐年增加，手术有效率愈发被重视，PCO 也被逐渐重视。PCO 又称后囊膜混浊，是白内障术后一种主要的远期并发症，是患者远期视力下降和再失明等视觉障碍的主要原因[8-10]。Nd：YAG激光后囊切开可以消除后囊膜光学区混浊，是目前治疗PCO 引起视觉质量下降的主要治疗手段[11]。虽然该技术简便、高效且耗时短，但可能产生黄斑囊样病变、视网膜脱离、继发性高眼压等并发症，且有损伤人工晶状体可能[12]。因此，对于PCO 的预防比治疗更为重要。

PCO 的发生机制主要是白内障手术后残留晶状体上皮细胞(lens epithelial cell，LEC)的迁移和增殖，及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)分化为成纤维细胞和晶状体纤维样细胞引起的[9-10]。因此，目前预防PCO 发生的研究主要集中在白内障术中清除残余LEC 或抑制LEC 增殖。在临床研究中，通过提高手术技术[13]、人工晶体设计[14-15]及囊袋张力环运用[16]等方法来尝试预防PCO；在实验室研究中，更多的抗代谢药物[17-18]及基因疗法[19]，被用以防治PCO；但这些方法需考虑人工晶状体稳定性、药物毒性、缺乏靶向性等方面风险，都无法安全、有效地预防远期PCO。

端粒位于真核细胞染色体的末端，与端粒结合蛋白一起保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期，随着细胞有丝分裂的进行，端粒的长度不断缩短，最终导致细胞的衰老死亡[20]。端粒酶是一种能延长端粒末端的核蛋白酶，以自身的 RNA 为模板，合成端粒重复序列，使端粒维持。端粒酶的激活使端粒长度不断延长，细胞获得异常增殖的能力，成为永生化细胞。人TERT 是端粒酶的催化亚单位，TERT mRNA 表达受到严格控制。因此，TERT 是决定端粒酶活性的限速决定因子[21]。大多数癌细胞通过激活或上调正常沉默的TERT 基因来调控端粒酶活性，从而实现增殖不朽[22]。我们的前期研究[3]发现，兔晶状体赤道部囊膜组织、混浊后囊膜晶状体上皮细胞中均存在端粒酶活性；与Colitz等[23]研究相似，在正常实验动物的晶状体上皮细胞中可检测出端粒酶活性，而白内障组晶状体上皮细胞中的端粒酶活性和端粒长度明显大于正常组。因此，我们推测手术、炎症等刺激因素可以上调TERT 来激活端粒酶活性，调控LEC 的增殖。

抑制TERT 的表达可以抑制端粒酶的活性，达到直接或间接参与调控细胞凋亡基因的表达。通过基因靶向干扰技术，沉默TERT 基因，调控端粒酶表达，已经在一些疾病中得到一些成果。在临床研究中抑制TERT 基因：可以抑制CNE-2R 细胞增殖，增强鼻咽癌放疗敏感性[24]；可以协同抑制口腔鳞状细胞癌肿瘤细胞增殖并加速细胞凋亡[25]；可以抑制肾细胞癌、食管鳞癌等的细胞活力和迁移[26-27]。为了解抑制TERT 基因与PCO 关系，我们以端粒酶活性高度相关的催化亚基TERT 作为靶点，通过siRNA转染，在术后第4 周，观察到实验组兔子的后囊膜混浊程度轻于对照组，差异有统计学意义。在术后第4 周，行后囊膜组织病理检查，见实验组后囊膜下的上皮细胞分布均匀，少量成纤维细胞增殖，对照组后囊膜多层成纤维细胞增殖，排列紧密，囊膜结构紊乱。α-SMA 在EMT 过程中被激活表达，改变了原有的LEC 生物学状态，使其出现异常的增生、迁移和纤维化，参与PCO 的发生、发展过程[28-29]，可以将α-SMA 作为LEC 增殖的标志物，是PCO 进展的重要观察指标。我们通过Western 印迹法检测，发现实验组α-SMA 相对表达量明显低于对照组，表明实验组LEC 的增殖活性及PCO 程度均低于对照组。因此，我们认为靶向抑制TERT 表达，可以降低LEC 端粒酶活性，从而抑制LEC 的迁移与增殖，达到抑制早期PCO 发生的作用。

在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到严格调控，只有在癌细胞、干细胞和生殖细胞中才能检测到具有活性的端粒酶[22]。已有研究[23,30]证明，眼内晶状体纤维细胞、角膜上皮细胞、内皮细胞、睫状体无色素细胞中均未发现端粒酶表达。故通过靶向TERT-siRNA 抑制LEC 端粒酶活性方法，理论上对眼内其他组织细胞应不会产生损害。本实验siRNA的载体所用为重组腺病毒(Adv)，已去除EI 区，不产生复制型腺病毒，无法在体细胞内复制，生物安全性高。结合本实验结果：术后第1 天及第1 周、2组间的角膜水肿与前房闪辉比较，差异均无统计学意义，且在术后第1 周时2 组的角膜水肿与前方闪辉均大部分恢复正常；术后第4 周，2 组的角膜、虹膜组织病理检查见各层组织结构完整，细胞排列整齐，未见明显水肿，未见明显炎性细胞浸润。我们认为，以重组腺病毒为载体的靶向TERT-siRNA 对眼前段其他组织无明显毒性作用，是一种安全的基因干扰技术。

因此，靶向TERT 基因siRNA 通过下调TERT表达，抑制LEC 端粒酶活性，可有效抑制LEC 的增殖与迁移，抑制兔早期PCO 的发生，且对眼前段各组织无明显毒性作用，为基因预防及药物治疗PCO 提供了研究方向。由于实验条件所限，本实验尚有不足之处，如观察时间较短，缺乏视网膜组织病理学检查、组织细胞凋亡情况，以及未对LEC 增殖进行多因素定量研究。其远期效果及局部安全性有待进一步研究观察。