环状RNA的体外构建及表达

唐琪，刘宏博，张哲罡，张家友，曹慧，杨晓明

1.武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北 武汉 430207；2.国家联合疫苗工程技术研究中心，湖北 武汉 430207；3.北京生物制品研究所有限责任公司质量保证部，北京 100029；4.中国生物技术股份有限公司，北京 100029

环状RNA（circular RNA，circRNA）最早被认为是一类调控微小RNA（micro RNA，miRNA），称为“miRNA海绵”的非编码RNA［1-3］，目前仅部分内源性circRNA被证明可作为蛋白质翻译模板［4］。随着circRNA 的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）与开放阅读框（open read frame，ORF）的发现［5］，circRNA的编码表达潜力逐渐引起关注［6-7］。不同于线性构象的mRNA，circRNA 是单链共价闭环结构［8］，无5'帽结构和3'聚腺苷酸化（polyA）尾巴，高度稳定，不易被核酸外切酶降解［9］。相比于mRNA体外制备过程，circRNA的体外合成省去了加帽、加尾工序，制备成本更低［10］。另有报道称，RNA环化可降低自身免疫原性，延长体内表达时间，进一步减少RNA修饰等加工步骤［11］，有望成为继mRNA 疫苗下一代的新型核酸疫苗［12］。此外，circRNA在肿瘤治疗领域也展现出极大潜力［13-14］。

在WESSELHOEFT 等［6］的研究中，根据真核生物内含子外显子置换（permuted intron exon，PIE）策略，利用Ⅰ型催化内含子（groupⅠcatalytic intron）自剪接核酶的序列特点设计了RNA 体外环化（in vitrocyclization，IVC）所需的环化臂，选取柯萨奇病毒B3（Coxsackievirus B3，CVB3）株的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）作为circRNA 翻译起始元件，表达了高西亚荧光素酶（Gaussia luciferase，GLuc）。同样，QU 等［15］在狂犬病疫苗的研究中，也采用该形式环化的circRNA 获得极佳的抗原表达及免疫效果。考虑到目的蛋白大小和类型对circRNA 表达的影响，本研究依次选取714 bp的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）、1 653 bp的萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，Fluc）及1 602 bp 的流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）IVR-180 基因序列构建模板质粒并IVC RNA，转染HEK-293T 细胞观察表达情况，探讨circRNA 在示踪表达及流感疫苗应用上的可能性。

1 材料与方法

1.1 细胞 HEK-293T 细胞由武汉生物制品研究所有限责任公司提供。

1.2 主要试剂及仪器 体外转录试剂盒（货号：R70-18M）、萤火虫荧光素酶检测试剂盒（货号：RG006）购自上海碧云天生物技术有限责任公司；核糖核酸酶R（RibonucleaseR，RNase R）（货号：R0301S）购自吉赛生物有限责任公司；LiCl（货号：AM9480）、细胞转染试剂lip3000（货号：L3000-015）、酶标仪购自美国Thermo公司；绵羊来源的HA IVR-180多抗（编号：17／106）购自中国食品药品检定研究院；偶联辣根过氧化物酶的驴抗绵羊抗体购自生工生物工程（上海）股份有限责任公司。

1.3 模板线性化及体外转录（in vitrotranscription，IVT） 环化模板序列主要由Ⅰ型催化内含子环化臂、CVB3-IRES 翻译起始元件及目的基因构成，分别包含目的基因EGFP、Fluc、HA（IVR-180）的环化模板扩增质粒pB-circRNA-EGFP、pB-circRNA-Fluc、pBcircRNA-HA［均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成］。在转录序列两侧环化臂上设计上下游引物（F1：5'-ATTAAGTTGGGTAACGCC-3'，R1：-CTAGATATGCTGTTATCCGTC-3'），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用PCR分别线性化EGFPcircRNA、Fluc-circRNA、HA-circRNA 的IVT 模板，经1%琼脂糖凝胶电泳及切胶回收纯化该线性模板；取0.5 µg DNA，20 µL 转录体系37 ℃孵育2 h；加入无RNA 酶水80 µL 及1 µL DNaseⅠ，进行DNA 模板消化，37 ℃5 min。

1.4 IVC、RNase R 消化及LiCl纯化 制备终浓度含250 mmol／L Tris-HCl、50 mmol／L MgCl2、5 mmol／L DTT、10 mmol／L GTP，pH 7.5的环化试剂。取1.3项80 µL IVT 产物与20 µL 环化试剂混匀，55 ℃孵育15 ～30 min完成IVC；用RNase R消化circRNA，37 ℃孵育10 min；用终浓度2.5 mol／L LiCl，-20 ℃沉降1 h；4 ℃，10 000 ×g离心10 min；弃上清，用无RNA酶水复溶沉降物。

1.5 HEK-293T细胞培养及circRNA转染 用含10%新生牛血清的DMEM培养基37 ℃，5%CO2培养HEK-293T 细胞，经3 次传代培养后生长至70% ～80%汇合度时，按1 × 106个／孔铺至6 孔板中，培养过夜；取circRNA 与lip3000 混合，室温孵育15 min；加至6孔板对应细胞孔中，每孔转染1 ～3 μg circRNA，于37 ℃，5%CO2培养箱中孵育适当时间。

1.6 EGFP 在HEK-293T 细胞中表达的检测分别将EGFP-circRNA 环化前后1µg 核酸与3µL lip3000 混合孵育后转染HEK-293T 细胞，分别于转染后24、48、96及144 h，收集细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光，曝光时间为200 ms，拍照并记录。

1.7 Fluc在HEK-293T细胞中表达的检测 分别将1、2、3 µg Fluc-circRNA 与5 µL lip3000 混合孵育后转染HEK-293T 细胞，转染后24 h 收集细胞，裂解释放蛋白，与荧光底物混合，于酶标仪下检测荧光数值（relative light unit，RLU），对circRNA 的表达能力进行相对定量并分析。以未转染Fluc-circRNA 的细胞裂解液为空白对照。具体操作按照萤火虫荧光素酶检测试剂盒说明书进行。

1.8 HA在HEK-293T细胞中表达的检测 采用Western blot 法。将2µg HA-circRNA 与5µL lip3000 混合孵育后转染HEK-293T 细胞，转染后24 h 收集细胞，用RIPA 裂解液裂解细胞，提取蛋白，与还原性loading buffer 混匀后100 ℃煮沸10 min，制备SDS-PAGE 样品。将样品经12%SDS-PAGE 分离及转膜后，用5%脱脂牛奶封闭过夜；以绵羊来源的HA IVR-180 多抗为一抗，4 ℃孵育过夜；以偶联辣根过氧化物酶的驴抗绵羊抗体为二抗，室温孵育2 h；将自发光底物涂于孵育后膜表面，于成像仪下扫描拍照并记录。

1.9 统计学分析 实验数据采用GraphPad Prism 8.0软件进行非配对t检验分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 包含Ⅰ型催化内含子结构的RNA 环化模板鉴定 IVT 的模板扩增质粒pB-circRNA-EGFP、pBcircRNA-Fluc、pB-circRNA-HA的结构见图1，分别借由上、下游PCR获得线性化DNA模板，再经IVT获得线性RNA，在环化试剂作用下以包含Ⅰ型催化内含子的5'和3'环化臂配对进行自剪接反应，完成环化并因环化臂的脱落产生小片段。

图1 模板扩增质粒结构及circRNA IVC示意图Fig.1 Schematic diagram of template amplification plasmid structure and circRNA IVC

2.2 IVC后RNA抵抗RNase R 消化 由IVT环化的RNA 因其环化过程脱落2 条大小不一的环化臂，其电泳条带变小，同时泳道中增加了2 个小条带，以EGFP-circRNA 环化为例，见图2A。用RNase R 分别消化环化前后RNA，未环化RNA 完全降解，而环化后RNA 可部分保留；此外，将环化时间由15 min 延长至30 min，发现环化泳道中RNA的弥散方式改变，且经RNase R 消化后保留的RNA 有所增加。鉴于RNase R 消化方式，可利用其对环化后RNA 进行纯化。见图2B。

图2 EGFP-circRNA 环化及RNase R 消化处理的核酸电泳图Fig.2 NucleicacidelectrophoreticprofilesofEGFP-circRNA cyclization and RNase R digestion treatment

2.3 EGFP-circRNA在HEK-293T细胞中的表达 转染EGFP-circRNA 环化RNA 的HEK-293T 细胞在24、48、96、144 h，于荧光显微镜下均可见明显的绿色荧光；连续培养144 h 后，HEK-293T 细胞开始出现堆积、漂浮；而转染未环化RNA 的HEK-293T 细胞均未见荧光。见图3。表明含有IRES-CVB3 翻译起始元件的RNA，其环化对于蛋白的表达是必要的，且在转染后24 h即有较好表达。

图3 EGFP-circRNA 转染后HEK-293T 细胞的荧光显微镜观察（×20）Fig.3 Fluorescence microscope observation of HEK-293T cells transfected with EGFP-circRNA（×20）

2.4 Fluc-circRNA在HEK-293T细胞中的表达将表达的目的蛋白更换为相对分子质量较大的Fluc 蛋白，IVC前Fluc-circRNA转录表达的荧光值为87.50，约为空白对照组（16.67）的5 倍，而IVC 后Fluc-circ-RNA 的表达更显著，1、2 和3 µg 转染剂量组平均荧光值分别为2 116.67、3 250.00 和3 795.83，分别为空白对照组的127（t= 40.93，P＜0.000 1）、195（t=17.27，P＜0.000 1）、228倍（t=24.35，P＜0.000 1）。见图4。

图4 Fluc蛋白表达检测的荧光数值Fig.4 RLU for Fluc expression detection

2.5 HA-circRNA在HEK-293T细胞中的表达 Western blot分析显示，circRNA上有HA蛋白表达，见图5。

图5 HA 蛋白在HEK-293T 细胞上表达的Western blot分析Fig.5 Western blotting of HA protein expressed in HEK-293T cells

3 讨论

2019年，SARS-CoV-2的暴发推动了全球mRNA疫苗领域的飞速发展［16-17］，但mRNA疫苗在体内递送和储存方面的问题增加了生产和运输成本［18］。相比之下，circRNA 的环形结构不易被RNA 酶降解，其稳定性更适于RNA水平生物信息的传递及处理［19-20］，尤其是随着可编码circRNA的发现，使其成为继mRNA疫苗后最具潜力的新型核酸疫苗［4］。人工设计的circRNA已在COVID-19 及难以治疗的黑色素瘤恶性肿瘤中表现出预防及治疗效果［21-22］。

本研究参考WESSELHOEFT 等［6］方法，利用Ⅰ型催化内含子结构构建的5'和3'环化臂及IRES-CVB3翻译起始元件成功表达了报告基因EGFP、Fluc及具有应用价值的流感HA。该种RNA IVC 方式是利用PIE策略中双酯交换反应，因此在环化过程中产生两端同源臂脱落的小片段，可据此作为IVC 发生的标志。虽然文献［6］显示该方法环化率高达90%以上，但经RNase R 处理过的RNA 条带灰度不到50%，可能如QU 等［15］的研究结果，较长时间的RNase R 处理会对circRNA 产生一定降解作用。此外，本研究在circRNA 表达EGFP时，转染未环化的RNA未观察到绿色荧光，而在Fluc的表达中，IVT-RNA 组检测到的数值比空白组高5倍，提示该circRNA 上元件在环化前线性RNA 形态下也有一定的表达功能，或者能在未添加环化试剂时自发环化。最后，利用流感HA（IVR-180）抗原蛋白也验证了这种体外制备可编码circRNA骨架的普遍适用性，同时也为流感HA-circRNA疫苗的研究奠定了基础。