靶向沉默CXCL5对喉鳞状细胞癌AMC-HN-8细胞生物学功能的影响及其调控分析

谢晓丹，韩瑞，卜倩倩，李梦璐，张亚楠，黄赛亚，皇甫辉

山西医科大学第一临床医学院，山西 太原 030000

喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是头颈部肿瘤中常见的恶性肿瘤之一，占我国耳鼻咽喉部恶性肿瘤的7.9%～35%，列头颈部恶性肿瘤的第3 位［1］。近40 年来，LSCC 发病率明显增加，发病年龄以40 ～60 岁最多，吸烟和饮酒可协同增高患LSCC 的危险性［1-2］。临床治疗目前主要采取以手术为主的多学科综合治疗［3］，但多数LSCC 患者就诊时已失去最佳手术时机。LSCC 细胞与其他恶性肿瘤细胞一样，具有无限繁殖、易转移、耐药等特点，手术治疗后存在较大的复发及放化疗耐受风险。因此，在LSCC 早期诊断及寻找新的治疗靶点成为研究的重点领域。

趋化因子是一种趋化性细胞因子，可调节免疫细胞在炎症刺激下进入受损或病变器官的迁移［4-5］。根据其N-末端半胱氨酸残基的不同，可分为4 个主要亚家族：CXCL、CC、C和CX3C。CXCL5属于趋化因子家族中的一员，其基因定位于4号染色体q13-q21部位，CXCR2 是其特异性受体，CXCL5 可结合CXCR2介导血管增生，也可影响肿瘤的增殖及转移［6-8］。CXCL5在多种癌症中表达上调并参与肿瘤进展，但CXCL5在LSCC中的作用及机制尚不清楚。

因此，本研究在LSCC组织及细胞中验证了CXCL5的表达情况，通过靶向沉默CXCL5后分析对其生物学功能的影响，并通过TCGA 数据库分析CXCL5基因在LSCC 发展过程中涉及的免疫浸润分析、互作基因等，以期为LSCC 的早期诊断、靶向治疗等提供新方法。

1 材料与方法

1.1 资料从TCGA（http：／／cancergenome.nih.gov／）数据库中下载头颈鳞癌（head-neck squamous cell carcinoma，HNSC）的CXCL5基因RNA-seq 数据，保留发病部位为喉部（larynx）或喉咽部（hypopharynx）部位的样本。

1.2 样本及细胞 选取2019 年1 月—2020 年12 月山西医科大学第一医院60 例病理科手术切除的LSCC 及相应癌旁组织样本，所有样本经病理学诊断均确诊为LSCC，本研究获得山西省伦理委员会批准（2018044）；LSCC 细胞系AM-HN-8 和293T 人胚肾上皮细胞由山西省耳鼻咽喉重点实验室提供。

1.3 主要试剂及仪器 DAB 显色试剂盒、羊血清、增强酶标山羊抗兔IgG 聚合物购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗CXCL5单抗（EP13083）购自美国Abcam公司；逆转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；CCK8试剂盒购自美国APExBIO 生物技术有限公司；Transwell试剂盒购自美国Corning公司；流式细胞仪（ACEA NovoCyte3130）购自美国艾森公司。

1.4 TCGA 数据库分析CXCL5 在LSCC 中的表达 TCGA 数据库中下载得到肿瘤组织样本119 份、癌旁组织样本44 份，利用limma 包对二者进行差异表达分析，差异基因筛选条件为［log2（fold change）］＞0.5＆adj.P.Val ＜0.05。

1.5 细胞培养 用含5%胎牛血清、1%青链霉素、1%谷氨酰胺的DMEM培养基，于37 ℃，5%CO2恒温培养箱内培养人LSCC细胞AMC-HN-8。

1.6 LSCC 组织中CXCL5 蛋白表达水平的检测 采用免疫组织化学染色法。将石蜡包埋的组织切片常规脱蜡，二甲苯、乙醇梯度脱水；抗原经高温高压EDTA 修复后，切片浸入新鲜配置的3%H2O2甲醇溶液，室温避光孵育10 min；加入封闭液（羊血清），室温孵育20 min；加入兔抗CXCL5单抗（1∶100稀释），4 ℃湿盒孵育过夜；加入增强酶标山羊抗兔IgG 聚合物（1∶100 稀释），室温孵育60 min；DAB 显色，复染封片。胞浆内有棕色颗粒判定为阳性细胞，计数阳性细胞率，＜10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2 分，51% ～75%为3 分，＞75%为4 分；染色强度根据德国免疫反应评分评估，无染色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，褐色为3 分；两评分乘积为CXCL5的最终免疫组化染色得分。最终得分标准以阳性细胞率＞50%、染色强度为棕黄色及褐色为高表达组；以阳性细胞率≤50%、染色强度为淡黄色以下为低表达组。

1.7 AMC-HN-8细胞中CXCL5mRNA转录水平的检测 采用qPCR 法。待AMC-HN-8 细胞呈指数生长后收集细胞沉淀，根据Trizol 试剂说明书，提取细胞中总RNA，反转录后合成cDNA 第一链，以其为模板，以293T 细胞为对照组，18S 为内参，qPCR 法进行定量分析。试验重复3次。CXCL5上游引物序列为：5'-ATCAGTAATCTGCAAGTGTTCG-3'，下游引物序列为：5'-CAAGACAAATTTCCTTCCCGTT-3'；18S 上游引物序列为：5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3'，下游引物序列为：5'-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。qPCR反应条件：95 ℃10 s，60 ℃30 s，95 ℃15 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量。

1.8 siRNA敲降后的细胞功能试验

1.8.1 siRNA 敲降效率检测 由上海吉玛制药技术有限公司特异性合成3 组siRNA：siRNA-1（CXCL5-homo-438）、siRNA-2（CXCL5-homo-253）、siRNA-3（CXCL5-homo-307），并设空白对照（NC）组。将各组siRNA 分别转染AMC-HN-8 细胞，进行qPCR 检测。试验重复3 次。筛选出敲降效率较好的2 组siRNA进行后续试验。

1.8.2 细胞增殖试验 采用CCK8 试剂盒检测细胞增殖能力。将转染后各组细胞计数，加至96 孔板中，每孔8 000 ～10 000 个，置37 ℃，5% CO2细胞培养箱培养；细胞贴壁后，收集0、24、48、72 h 细胞，上酶标仪，于450 nm 波长处读取吸光度值。试验重复3次。

1.8.3 Transwell 细胞侵袭试验 取各组转染24 h 细胞，提前饥饿处理8 h；计数并调整细胞数为1 × 106个，用1 mL 无血清培养基重悬，上室（提前稀释Matrigel 基质胶，置37 ℃培养箱使胶凝固）加入200µL 细胞悬液，下室加入600 µL 含25%胎牛血清的培养基，37 ℃，5%CO2细胞培养箱培养2 ～3 d；4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色。试验重复3 次。显微镜下统计穿过小室的细胞数量，并计算相对倍数。

1.8.4 Transwell 细胞迁移试验 取各组转染24 h 细胞，提前饥饿处理8 h；计数并调整细胞数为5 × 105个，并用1 mL 无血清培养基重悬，上室加入200 µL细胞悬液，下室加入600µL 含25%胎牛血清的培养基，37 ℃，5%CO2细胞培养箱培养1 ～2 d；4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色。试验重复3 次。显微镜下统计穿过小室的细胞数量，并计算相对倍数。

1.8.5 细胞周期试验 将敲降效率较高的2条siRNA及NC 组细胞均转染48 h 后，1 000×g离心5 min，收集细胞，沉淀用预冷的75%乙醇混匀，4 ℃固定过夜；次日1 000×g离心5 min，收集细胞沉淀，PBS重悬细胞；加入300µL染色液（染色缓冲液∶PI∶RNaseA=50∶1∶1）重悬细胞，37 ℃避光孵育30 min；上流式细胞仪（488 nm波长处）进行检测。试验重复3次。

1.8.6 细胞凋亡试验 将敲降效率较高的2条siRNA及NC组各组细胞均转染48 h后，1 000×g离心5 min，收集细胞，预冷PBS 混匀，离心收集细胞沉淀，用1×Binding Buffer 结合缓冲液重悬细胞后，调整细胞浓度至（1 ～5）×106个／mL；将500µL细胞悬液与5µL Annexin V FITC混匀，室温避光孵育5 min；加入10µL PI，混匀，室温孵育30 min；上流式细胞仪（488 nm 波长处）进行检测。试验重复3次。

1.9CXCL5免疫细胞浸润分析及其共表达网络富集分析 使用ssGSEA 方法进一步对高低表达的2组样本进行免疫细胞浸润分析，利用R软件对该2组样本进行ssGSEA 分析，推算浸润免疫细胞的比例，再采用wilcox.test检验进行相关性分析。在LSCC 中计算CXCL5基因与其他基因之间的pearson相关性，筛选|cor| ＞0.6 ＆P＜0.05 的关系对构建CXCL5的共表达网络，并进行基于GO和KEGG的富集分析。

1.10 统计学分析 采用SPSS 23.0 软件对实验数据进行统计学分析，正态分布性数据以均数±标准差表示，数据比较采用t检验；采用GraphPad Prism 软件对实验数据进行绘图及统计分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CXCL5在LSCC组织中表达上调量的改变

2.1.1CXCL5基因在LSCC 组织中的表达 TCGA 数据库分析显示，CXCL5基因在LSCC 组织中表达上调，与癌旁组织相比，差异有统计学意义（t=2.830，P＜0.01），见图1。

图1 CXCL5在正常组织和LSCC组织中表达的箱线图Fig.1 Box diagram of CXCL5 expression in normal tissue and LSCC tissue

2.1.2 CXCL5 蛋白在LSCC 组织中的表达 CXCL5蛋白阳性染色为棕色颗粒样，主要定位于细胞浆，见图2。在相同判定标准下，LSCC 组织阳性染色得分明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.001），见表1。表明CXCL5在LSCC组织中高表达。

图2 免疫组织化学染色法观察CXCL5 蛋白在人LSCC组织中的表达（×200）Fig. 2 Expression of CXCL5 protein in human LSCC tissues observed by immunohistochemical staining（×200）

表1 免疫组织化学染色法评分表Tab.1 Scoring table of immunohistochemical staining

2.1.3 LSCC 细胞中CXCL5mRNA 表达水平 LSCC细胞中CXCL5mRNA 转录水平显著高于对照组（t=5.490，P＜0.01），见表2。

表2 LSCC细胞中CXCL5 mRNA转录水平的定量分析Tab.2 Quantitative analysis of CXCL5 mRNA expression in LSCC cells

2.2 细胞功能试验

2.2.1 3条siRNA敲降效率CXCL5-homo-438、CXCL5-homo-253、CXCL5-homo-307 组转染后的细胞表达量分别为0.502±0.045、0.3275±0.169、0.6497±0.034，与NC组（1.001±0.066）相比，差异有统计学意义（P＜0.01），表明siRNA-1和siRNA-2敲降效率较好，见图3。选择siRNA-1和siRNA-2进行后续试验。

图3 qPCR法检测转染siRNA后细胞的表达水平Fig.3 Detection of expression level in cells transfected with siRNA by qPCR

2.2.2 siRNA 干扰CXCL5对LSCC 细胞增殖活性的影响CXCL5-homo-438、CXCL5-homo-253 组细胞各时间段增殖速度均慢于NC组（P＜0.05），见图4。

图4 CCK-8试验检测敲降CXCL5后对LSCC 细胞增殖的影响Fig.4 Detection of effect of CXCL5 knock-down on proliferation of LSCC cells by CCK-8 assay

2.2.3 siRNA 干扰CXCL5对LSCC 细胞侵袭的影响CXCL5-homo-438、CXCL5-homo-253 组穿过Transwell小室的细胞数分别为NC组的（0.283±0.033）、（0.528±0.043）倍（P＜0.001），相比于NC 组的细胞数减少，可知CXCL5具有促进LSCC 细胞侵袭的能力，见图5和图6。

图5 Transwell试验检测敲降CXCL5后对LSCC细胞侵袭能力的影响（免疫组织化学染色，×100）Fig.5 Detection of effect of CXCL5 knock-down on invasive ability of LSCC cells by Transwell test（immunohistochemical staining，×100）

图6 敲降CXCL5后LSCC细胞侵袭能力的变化Fig.6 Changes of invasion ability of LSCC cells after knocking down CXCL5

2.2.4 siRNA 干扰CXCL5对LSCC 细胞迁移的影响CXCL5-homo-438、CXCL5-homo-253 组穿过Transwell小室的细胞数分别为NC组的（0.276±0.048）、（0.481±0.020）倍（P＜0.001），相比于NC 组的细胞数减少，可知CXCL5具有促进LSCC 细胞迁移的能力，见图7和图8。

图7 Transwell试验检测敲降CXCL5后对LSCC细胞迁移能力的影响（免疫组织化学染色，×100）Fig.7 Detection of effect of CXCL5 knock-down on migration ability of LSCC cells by Transwell test（immunohistochemical staining，×100）

图8 敲降CXCL5后LSCC细胞迁移能力的变化Fig.8 Changes of migration ability of LSCC cells after knocking down CXCL5

2.2.5 siRNA 干扰CXCL5对LSCC 细胞周期的影响CXCL5-homo-438 组的GO／G1、S、G2／M 期所占比例分别为（57.357 ± 0.793）%、（27.833 ± 1.372）%、（14.810±0.754）%；CXCL5-homo-253组的GO／G1、S、G2／M 期所占比例分别为（55.877 ± 0.533）%、（33.907±1.589）%、（10.217±1.056）%；NC 组GO／G1、S、G2／M期所占比例分别为（42.457±0.810）%、（49.807±0.595）%、（7.560±0.472）%。表明CXCL5主要通过G1期对LSCC细胞进行周期阻滞，2个干扰组与对照组相比，差异均有统计意义（P＜0.01）。见图9。

图9 流式细胞仪检测敲降CXCL5后对LSCC细胞周期的影响Fig.9 Detection of effect of CXCL5 knock-down on cell cycle of LSCC cells by flow cytometry

2.2.6 siRNA 干扰CXCL5对LSCC 细胞凋亡的影响CXCL5-homo-438、CXCL5-homo-253、NC 组的凋亡率分别为（6.110±1.533）%、（6.657±1.671）%、（2.903±0.768）%。表明CXCL5可促进LSCC 细胞凋亡，2 个干扰组与对照组相比，差异均有统计意义（P＜0.05）。见图10。

图10 流式细胞仪检测敲降CXCL5后对LSCC细胞凋亡的影响Fig.10 Detection of effect of CXCL5 knock-down on apop-tosis of LSCC cells by flow cytometry

2.3CXCL5免疫细胞浸润分析及其共表达网络ssGSEA 分析发现，仅有DC（t= -2.215，P＜0.05）、中性粒细胞（neutrophils）（t=-3.136，P＜0.01）、NK（t= 2.485，P＜0.05）和Th17（t= -3.186，P＜0.01）免疫细胞评分在高低表达2 组样本间存在差异，见图11。获得与CXCL5相关的20 个基因，见图12。GO 富集分析显示，共富集到调节细胞因子分泌（regulation of cytokine secretion）、白细胞迁移（leukocyte migration）、趋化因子——介导的信号通路（chemokine-mediated signaling pathway）、趋化因子应激性（response to chemokine）、中性粒细胞趋化性（neutrophil chemotaxis）等免疫相关通路。KEGG 富集分析显示，共富集到病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用（viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）通路、趋化因子信号通路（chemo kine signaling pathway）、细胞因子受体相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）通路。见图13 和图14。

图11 免疫细胞浸润分析Fig.11 Immune cell infiltration analysis

图12 CXCL5共表达网络Fig.12 CXCL5 co-expression network

图13 共表达基因GO富集分析Fig.13 GO enrichment analysis of co-expressed genes

3 讨论

LSCC 是严重威胁人类健康的一类恶性肿瘤，近年来LSCC 的治疗取得了显著的进展，手术仍是其治疗的主要手段，包括生物治疗在内的综合治疗已成为可行的选择［2］。但目前LSCC 的发病机制仍不十分明确，尚无明确的靶向治疗靶点。

本研究通过LSCC 组织免疫组织化学试验验证，与癌旁组织相比，CXCL5在LSCC 组织中的表达量增高，与TCGA数据库分析一致。通过qPCR检测，与正常293T 细胞相比，CXCL5在LSCC 细胞系AMC-HN-8中的表达量也明显上调。在体外试验中，通过转染siRNA分析可知，CXCL5可促进LSCC 的增殖、侵袭及迁移，表明与胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤一样，CXCL5可能会成为LSCC潜在的治疗靶点之一。

CXCL5 在许多癌症的发生发展中起重要作用。大量研究表明，在结直肠癌［9］、胃癌［10-11］、肝癌［12］、胰腺癌［13］、乳腺癌［14］、前列腺癌［15］、膀胱癌［16-17］、肺癌［18］、宫颈癌［19］、胆管癌［20］等恶性肿瘤组织中均高表达，并与肿瘤的侵袭、转移及不良预后密切相关。有报道表明，在膀胱癌细胞系T24 中下调CXCL5的表达后，可通过Snail、PI3K-AKT 和ERK1／2 信号通路显著减少细胞增殖及迁移［16］。在肝癌中，ERK1／2、p38、MAPK 和JNK 通路的激活参与了CXCL5 诱导的肝癌细胞迁移及侵袭的调控（ERK1／2 信号通路可能在发挥更主要的作用），同时在肝癌细胞系MHCC97H中，通过siRNA下调CXCL5的表达可显著抑制细胞侵袭及迁移［12］。这与本研究结果一致，靶向沉默CXCL5的表达可抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移。

有文献报道，CXCL5／CXCR2生物轴在促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等肿瘤生物学中发挥重要作用［8］。CXCL5可结合CXCR2介导多种细胞包括中性粒细胞等招募以及肿瘤细胞迁移及转移［21］。在结直肠癌中，CXCL5／CXCR2轴被发现通过激活ERK／Elk-1／Snail和AKT／GSK3β／β-catenin通路，从而增强结直肠癌细胞的迁移及侵袭能力，沉默Snail 和／β-catenin信号通路可减弱CXCL5／CXCR2体外增强细胞迁移及侵袭能力［9，22］。在鼻咽癌中，CXCL5／CXCR2 轴可通过激活ERK／GSK-3β／Snail 信号通路促进肿瘤细胞迁移及侵袭［21］。但CXCL5／CXCR2生物轴在LSCC 细胞迁移及侵袭中的确切作用及其潜在机制尚不清楚，需进一步研究。

本研究通过数据库对CXCL5的互作基因分析发现，人巨噬细胞金属弹性蛋白（human macrophage metalloelastase，MMP12）与CXCL5互相影响最大，MMP12能广泛分解细胞外基质和血管壁成分，促进LSCC 转移［23］，提示CXCL5对LSCC发展的影响可能是一个复杂的生物学过程。

此外，肿瘤的发生发展与肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）相关。肿瘤通过TME 导致机体对肿瘤的免疫监视及免疫耐受失衡，减弱抗肿瘤免疫反应，维持增殖、逃避细胞凋亡以及保持炎性环境和血管生成等特征，从而促进肿瘤生长［24-25］，而且肿瘤细胞的侵袭及迁移也是通过TME中的信号通路启动和维持的。本研究通过分析发现，CXCL5在LSCC中的免疫浸润与DC、Neutrophils、NK 和Th17 免疫细胞相关。有文献报道，免疫细胞可沿着CXCL5浓度梯度向肿瘤TME 迁移［26］，表明CXCL5 可能通过改变TME导致机体对肿瘤免疫监视的逃避过程。

肿瘤的发生、发展还与TME 中的血管生成密切相关，过表达的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）诱导生成的丰富的血管为肿瘤组织的快速生长提供了更多的血液［11］。多项研究发现，CXCL5／CXCR2 生物轴在肿瘤血管生成中起重要作用，因CXCL5［属于ELR+CXC 类趋化因子，是含有ELR 基因序列（Glu-Leu-Arg，谷氨酸-亮氨酸-精氨酸）的一种亚型（CXC趋化因子家族又可分为ELR+和ELR-组，ELR+CXC类趋化因子被认为可促进血管生成［6-8］）］及其唯一已知的功能性受体CXCR2 在促血管生成、迁移、侵袭中发挥作用，CXCL5 通过激活CXCR2促进血管生成，因此有效阻断CXCL5／CXCR2通路可减少肿瘤的血液供应，从而减缓疾病进程［27］。

CXCL5 作为化疗药物的辅助剂，可提高药物疗效，目前受到广泛关注［27］。有文献报道，在肺癌中，中和CXCL5可提高酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼疗效，而不会增加相关副作用［28］。CXCR2 抑制剂可提高横纹肌肉瘤免疫治疗的有效性［29］。阻断CXCR2 可降低结直肠癌进展，并增加对铂类抗癌药物的敏感性［30］。抑制CXCR2 还可减少粒细胞向原发肿瘤区域的聚集，从而调节胰腺管癌的进展［31］。表明CXCL5及其受体CXCR2 在肿瘤恶性进展中具有重要作用，并且有可能成为肿瘤的潜在治疗靶点。

随着越来越多的研究揭示CXCL5与肿瘤的相关性，其相应的信号旁路也逐渐明确。由于CXCL5 高表达可促进LSCC 增殖、侵袭及迁移，因此CXCL5 可能成为预测LSCC 发展的新指标及其治疗的潜在靶点及策略。