黄芪甘草汤中总多糖提取工艺优化*

毛浩洋，董方昕，金可欣，李思明

（哈尔滨商业大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150076）

中药复方用于防治疾病历史悠久，现代药理学表明，中药复方作用具有多靶点、毒副作用较小的优势以及重要的研究价值[1]。黄芪甘草汤最早起源于《医林改错》，自宋代就已经被记载应用，具有大补元气、缓急止痛、运化水湿的功效[2]。

多糖类化合物在现代药理学研究中被证实具有调节免疫、抗肿瘤、保肝、抗炎、调节血糖、血脂等多重功效[3-5]。从天然中药中提取的多糖毒性小、活性高，兼有药物治疗作用和营养作用[6,7]。临床试验也证实，多糖可以减缓肝纤维化的进程，对肿瘤细胞具有靶向调节作用，可作为辅助药物用于肿瘤和癌症的化学治疗或放射性治疗[8,9]。

中药中多糖类成分的提取率普遍不高，但因其丰富的药理作用，一直是人们关注研究的焦点。本文将对黄芪甘草汤中总多糖提取工艺进行研究，筛选出最佳提取条件，为后续黄芪甘草汤中的多糖类成分研究奠定基础。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

中药材黄芩、甘草，购于哈尔滨三棵树药材市场百味堂药行；无水乙醇（AR ≥99.7% 天津市天力化学试剂有限公司）；无水葡萄糖标准品（分析标准品HPLC ≥98% 上海源叶生物科技有限公司）；石油醚、H2SO4，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；苯酚（AR 天津市致远化学试剂有限公司）；蒸馏水（哈尔滨市南岗区实林蒸馏水经销处）

1.2 仪器与设备

SE-750 型万能粉碎机（永康市圣象电器有限公司）；BT25S 型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；HH-2 型数显恒温水浴锅（金坛市荣华仪器制造有限公司）；RE-52AA 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器有限公司）；L-550 型台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；FD-550 型冷冻干燥机（上海一恒科技有限公司）；T6型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）

1.3 葡萄糖标准曲线的绘制

采用苯酚-硫酸法[10]测定糖含量。首先配制0.1mg·mL-1的葡萄糖标准液，分别精密吸取葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6 和0.8mL，再分别加入蒸馏水至1mL，加入6%苯酚1mL、浓H2SO45mL，混匀后在80℃水浴中加热30min，冷至室温。在490nm 条件下，测定6 份溶液的吸光度，并以吸光度A 作为纵坐标，葡萄糖浓度C 作为横坐标，绘制标准曲线。根据回归方程计算多糖含量。

多糖含量/%=C×V×D/m

式中 C：样品溶液多糖浓度，mg·mL-1；V：样品溶液体积，mL；D：稀释倍数；m：样品的质量，mg。

1.4 单因素实验

黄芪、甘草粉碎后置于石油醚中浸泡12h 进行脱脂，脱脂后将药材粉末烘干，称取黄芪5g、甘草1g，加入60mL 蒸馏水，温度为80℃，提取1h，回流提取3 次，合并3 次提取液，抽滤后进行旋蒸浓缩至30mL，浓缩液中加入4 倍量无水乙醇，4℃静置24h。离心收集沉淀，冷冻干燥24h 后得到多糖样品。根据表1 进行单因素实验，考察各因素对多糖得率的影响，平行实验3 次，取平均值。

表1 单因素实验表Tab.1 Single factor experiment

1.5 正交实验

以黄芪甘草汤中总多糖得率为评价指标，根据单因素实验结果，筛选出对多糖得率影响较大的因素进行L9（34）正交实验。

1.6 方法学考察

1.6.1 精密度实验 精密量取葡萄糖标准液1mL，在490nm 处重复测定吸光度6 次，计算相对标准偏差RSD 值。

1.6.2 稳定性实验 精密量取同一供试品溶液1mL，在490nm 处每隔30min 测1 次吸光度值，共测6 次，计算相对标准偏差RSD 值。

1.6.3 重复性实验 制备相同的供试品溶液6 份，测定6 组供试品溶液在490nm 处的吸光度值，计算相对标准偏差RSD 值。

1.6.4 加样回收实验 配制0.1mg·mL-1供试品溶液。精密吸取0.5mL 供试液6 份，置于6 个试管中，分别加入0.5mL 葡萄糖对照品溶液，测定6 组溶液的吸光度，计算平均回收率和相对标准偏差RSD值。

加样回收率=测定量/（样品加入量+对照品加入量）×100%

1.7 验证实验

根据正交实验筛选出的最佳提取工艺条件，分别称取3 份黄芪甘草汤药材粉末，在此条件下，重复3 次实验，验证该工艺的可行性。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取温度对黄芪甘草汤中多糖得率的影响

由图1 可见，黄芪甘草汤中多糖得率受提取温度的影响较大，伴随水浴温度的升高，呈现先升高后降低的趋势。当温度为80℃时，多糖得率最高，80～90℃之间，多糖得率呈下降趋势，高温可能会破坏多糖的结构，导致多糖分解，从而影响得率。因此，将温度作为考虑因素，选择70、80、90℃3 个水平进行正交实验。

图1 提取温度对黄芪甘草汤中多糖得率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide in Huangqi Gancao Tang

2.1.2 料液比对黄芪甘草汤中多糖得率的影响

由图2 可见，当料液比小于1∶20（g:mL）时，随料液比的增大，黄芪甘草汤中多糖的得率明显升高；料液比为1∶20（g∶mL）时，多糖得率最高；料液比超过1∶20（g∶mL）后，多糖得率反而降低。当溶剂较少时，多糖在溶剂中溶出逐渐趋于饱和，增加溶剂使多糖更容易溶出，但溶剂过多时其他水溶性物质也会随之溶出，影响多糖得率。因此，选择1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL）3 个水平进行正交实验。

图2 料液比对黄芪甘草汤中多糖得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polysaccharide in Huangqi Gancao Tang

2.1.3 提取时间对黄芪甘草汤中多糖得率的影响

由图3 可见，多糖得率随提取时间的增加并没有明显改变，提取时间为1h 时的多糖得率最高，随后降低，在2h 时有略微升高，随后逐渐降低。药材中多糖含量是一定的，在提取时间1h 内多糖可能全部溶出，总体而言，提取时间对多糖得率影响较小，所以不作为考虑因素，因此，在正交实验中选择最佳提取时间为1h。

图3 提取时间对黄芪甘草汤中多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharide in Huangqi Gancao Tang

2.1.4 提取次数对黄芪甘草汤中多糖得率的影响

由图4 可见，提取次数对黄芪甘草汤中多糖得率影响较小，虽然多糖得率随着提取次数的增加逐渐升高，但总体比较稳定，变化不明显，当提取3 次时，多糖得率趋于稳定，所以提取次数不作为考虑因素。综合实际而言，当提取次数为3 次时，更加节能省时，因此，选择最佳提取次数为3 次。

图4 提取次数对黄芪甘草汤中多糖得率的影响Fig.4 Effect of extraction times on the yield of polysaccharide in Huangqi Gancao Tang

2.1.5 脱脂时间对黄芪甘草汤中多糖得率的影响

由图5 可见，随着脱脂时间的增加，多糖得率呈现先上升后下降的趋势。当脱脂时间为6h 时，多糖得率最高，脱脂时间超过6h 后，多糖得率稍有下降。这是因为，长时间有机溶剂脱脂可能会破坏药材细胞壁结构，造成多糖流失。因此，对脱脂时间的筛选是必要的，故选择4、6、8h 脱脂时间进行正交实验。

图5 脱脂时间对黄芪甘草汤中多糖得率的影响Fig.5 Effect of degreasing time on the yield of polysaccharide in Huangqi Gancao Tang

2.2 正交实验结果

根据单因素考察结果，进行正交实验设计，见表2，正交实验结果见表3，正交实验结果方差分析见表4。

表3 正交实验结果Tab.3 Orthogonal experimental results

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

由表3 可见，RA＞RC＞RB，R 值的大小与多糖得率呈正相关，因此，多糖得率影响因素的大小顺序为：提取温度＞脱脂时间＞料液比。提取温度：K2＞K1＞K3，料液比：K2＞K3＞K1，脱脂时间：K2＞K3＞K1，K 值越大表示该水平对多糖得率的影响越大，因此，最优提取组合为A2B2C2，即提取温度为80℃、料液比为1∶20（g∶mL）、脱脂时间为6h、提取时间为1h、提取次数3 次。

由表4 可见，提取温度和料液比能够显著影响黄芪甘草汤中多糖得率（P＜0.05），而脱脂时间对于黄芪甘草汤中多糖得率无显著影响（P＞0.05）。

2.3 方法学考察结果

2.3.1 精密度实验 实验中测得吸光度分别为0.760、0.758、0.787、0.753、0.759、0.759，平均吸光度为0.763，计算RSD 值为1.6%，表明仪器精密度较高，测量值较准确。

2.3.2 稳定性实验 实验中测得吸光度分别为0.758、0.755、0.755、0.752、0.751、0.757，平均吸光度为0.755，RSD 值为0.4%，表明供试品溶液在3h 内稳定性良好。

2.3.3 重复性实验 实验中测得吸光度分别为0.745、0.744、0.746、0.745、0.745、0.746，平均吸光度为0.746，RSD 值为0.18%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 加样回收实验 加样回收率分别为98.47%、98.69%、101.29%、98.67%、101.53%、102.72%，平均加样回收率为100.23%，RSD 值为1.9%，表明该实验含量测定方法正确可靠。

2.4 验证实验结果

在最佳提取工艺（提取温度80℃、料液比1∶20（g∶mL）、脱脂时间6h、提取时间1h、提取次数3 次，平行实验3 次）条件下，3 次提取黄芪甘草汤中多糖的得率分别为9.56%、9.82%、9.75%，多糖平均得率为9.71%，且高于正交实验各组结果，表明该提取工艺稳定、可行。

3 结论

本文通过单因素与正交实验对黄芪甘草汤中总多糖成分进行提取工艺优化，得出黄芪甘草汤中总多糖平均得率为9.71%，该实验为中药复方多糖的提取以及后续黄芪甘草汤水提物中总多糖成分的生物活性和药理作用研究提供了参考和依据。