毛头牛蒡子总木脂素有效部位的化学成分研究*

葛 亮，刘富铭，田树革

（新疆医科大学 中医学院,新疆 乌鲁木齐 830000）

毛头牛蒡子为菊科牛蒡属毛头牛蒡（Arctium tomentosum Mill.）的干燥成熟果实，维吾尔名为“可热可孜乌拉盖”，在我国新疆地区分布广泛、资源丰富、历史悠久[1]。毛头牛蒡子含有多糖类、木脂素类、黄酮类等多种化学物质[2]，具有疏散风热、宣肺透疹等功效，具有抗衰老、保肝、抗肿瘤等药理学作用[3]。毛头牛蒡子含有较多的牛蒡苷，是天然产物牛蒡苷的重要药用资源[4]。

本项目前期已经考察了毛头牛蒡子总木脂素类成分的最佳提取工艺，并完成了对毛头牛蒡子总木脂素类成分的富集工艺研究，制备了毛头牛蒡子总木脂素有效部位。本实验是对毛头牛蒡子总木脂素有效部位中的有效成分进行分析，采用分光光度法检测其中总木脂素的含量，并采用HPLC 法检测其中牛蒡苷、牛蒡苷元的含量，为毛头牛蒡子总木脂素有效部位的下一步开发研究提供实验依据。

1 实验部分

1.1 材料、试剂及仪器

毛头牛蒡子（Arctium tomentosum Mill.）采集于新疆乌鲁木齐水磨沟区，晒干后剥出毛头牛蒡子，经新疆维吾尔自治区中医院李永和主任药师鉴定均为菊科牛蒡属植物毛头牛蒡的干燥成熟果实；牛蒡苷对照品（批号R1208F45507）、牛蒡苷元对照品（批号C14A8Q33977），纯度＞98%，上海源叶生物科技有限公司；HPD-100 大孔吸附树脂（河北沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；H3PO4、氯仿、H2SO4、乙醇，均为分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；甲醇（色谱醇 美国Fisher Scientific 公司）；超纯水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

岛津高效液相色谱仪（包括DGU-20A5 在线脱气机、LC-20AT 输液泵、CBM-20A 色谱工作站、SPD-20A 型紫外线检测器、SIL-20A 自动进样器、CTO-10ASVP 柱温箱，日本岛津公司）；Kromasil C18色谱柱（4.6mm×150mm，5μm，大连中汇达科学仪器有限公司）；TU-1810PC 型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；XS105 型万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；R-1001N 型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；LGJ-25C 型冷冻干燥机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；LG-500A 型高速中药粉碎机（浙江百信药机器械厂）；HH-4 型水浴锅（金坛市国旺实验仪器厂）；KQ-500VDE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 毛头牛蒡子总木脂素有效部位的制备

称取适量毛头牛蒡子药粉，加入15 倍量的58%乙醇回流提取2 次，每次提取62min[5]，浓缩药液至浓度以生药计为0.2g·mL-1，采用径高比为1∶10的带阀门玻璃柱，取已预处理的HPD-100 大孔吸附树脂，装柱，上样浓度为0.2g·mL-1，以1.5 BV·h-1的流速上样4BV，7BV 蒸馏水洗去水溶性杂质，4BV的70%乙醇以1BV·h-1的流速洗脱，收集洗脱液[6]，洗脱液浓缩至黏稠后，放至-80°C 冰箱冷冻，冷冻完全后在冷冻干燥机中干燥，成品为淡棕黄色松散粉末，放置在阴凉干燥处，备用。

1.3 溶液的配制

1.3.1 总木脂素含量测定所需对照品溶液 精密称取牛蒡苷对照品3mg 置于25mL 容量瓶中，加95 %乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀备用。

1.3.2 总木脂素含量测定所需供试品溶液 精密称取毛头牛蒡子总木脂素有效部位20mg，用95%乙醇超声至溶解并定容到10mL 容量瓶中，混匀即得。

1.3.3 牛蒡苷、牛蒡苷元含量测定所需对照品溶液精密称取牛蒡苷、牛蒡苷元对照品适量，分别置于10mL 容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为牛蒡苷储备液、牛蒡苷元储备液。再吸取适量牛蒡苷和牛蒡苷元储备液混合配成含牛蒡苷2mg·mL-1、牛蒡苷元0.1mg·mL-1的混合对照品溶液。

1.3.4 牛蒡苷、牛蒡苷元含量测定所需供试品溶液精密称取毛头牛蒡子总木脂素有效部位20mg，用甲醇超声至溶解并定容到10mL 容量瓶中，混匀即得。

1.4 色谱条件

Kromasil C18色谱柱（4.6mm×150mm，5μm）；流动相为甲醇-0.3%的磷酸水溶液，梯度洗脱，程序见表1；流速为1mL·min-1；检测波长为280nm；柱温为30℃；进样量为5μL。在该色谱条件下，牛蒡苷峰和牛蒡苷元峰的理论塔板数均不低于10000。液相色谱图见图1。

图1 HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

表1 高效液相色谱仪梯度洗脱程序Tab.1 Elution program of HPLC

2 结果与讨论

2.1 总木脂素含量测定的最大吸收波长的确定

分别取总木脂素含量测定所需对照品和供试品溶液，用紫外可见光分光光度计进行扫描，结果见图2。

图2 紫外可见光吸收光谱Fig.2 UV-Vis absorption spectrun

由图2 可见，对照品和供试品均在280nm 处有最大吸收峰，故确定测定波长为280nm。

2.2 总木脂素含量测定的方法学考察

2.2.1 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 分别置于10mL 容量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度摇匀，在280nm 波长处测定吸光度，以对照品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标作标准曲线，得回归方程：Y=11.4083X-0.0036，r=0.9993，表明牛蒡苷在0.024~0.072mg·mL-1浓度范围呈良好的线性关系，可以用此回归方程计算毛头牛蒡子总木脂素有效部位中总木脂素的含量。

2.2.2 精密度实验 精密吸取对照品溶液2mL 置于10mL 容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，在280nm 波长处测定吸光度，重复实验6 次测定吸光度值，计算RSD 值。结果表明，在连续6 次测定中，RSD 为0.2%，表明该方法精密度良好。

2.2.3 稳定性实验 精密吸取供试品溶液0.2mL 置于25mL 容量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度摇匀，分别于0.5、1、1.5、2、2.5、3h 在280nm 波长处测定其吸光度，计算RSD 值。结果得RSD 为0.34%，表明供试品溶液在3h 内稳定性良好。

2.2.4 重复性实验 精密称取同一批次毛头牛蒡子总木脂素有效部位6 份，按“1.3.2”的方法制备，在280nm 波长处测定吸光度，计算RSD 值。结果得RSD 为1.61%，表明测定方法重复性良好。

2.2.5 回收率实验 精密称取已知含量供试品6份，分别加入相同量的对照品，按“1.3.2”的方法制备，在280nm 波长处测定其吸光度，并计算其回收率和RSD，结果见表2，其平均回收率为102.48%，RSD 为1.05%，满足样品分析测试要求。

表2 回收率实验结果Tab.2 Result of recovery test

2.3 牛蒡苷、牛蒡苷元含量测定的方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL 分别置于5mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，分别进样测定。以峰面积（Y）对浓度（X）进行回归分析，得牛蒡苷的线性回归方程为：Y=2979087.48X+242806.27，r=0.9991，线性范围为0.2~2mg·mL-1。牛蒡苷元的线性回归方程为：Y=5575387.95X+10939.96，r=0.9995，牛蒡苷元的线性范围为0.01~0.1mg·mL-1。结果表明，牛蒡苷和牛蒡苷元峰面积和浓度呈良好的线性关系，可以计算毛头牛蒡子总木脂素有效部位中牛蒡苷和牛蒡苷元的含量。

2.3.2 精密度实验 取混合对照品溶液，按“1.4”色谱条件，连续进样6 次，测定各峰面积。计算得牛蒡苷峰面积的RSD 为0.83%，牛蒡苷元峰面积的RSD为1.15%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性实验 取供试品溶液，分别于放置0、2、4、6、8、12、24、48h 后进样测定，记录峰面积，计算得牛蒡苷含量的RSD 为0.94%，牛蒡苷元峰面积的RSD 为1.30%，表明供试品溶液在48h 内稳定性良好。

2.3.4 重复性实验 精密称取6 份总木脂素有效部位，按照“1.3.4”的方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积。计算得牛蒡苷的RSD 值为1.25%、牛蒡苷元的RSD 值为1.50%，表明实验重复性良好。

2.3.5 回收率实验 精密称取6 份总木脂素有效部位，分别精密加入牛蒡苷对照品0.56mg 和牛蒡苷元对照品0.032mg，按照“1.3.4”的方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，并计算其回收率和RSD，结果见表3，牛蒡苷的平均回收率为100.74%，RSD 为1.61%，牛蒡苷元的平均回收率为102.22%，RSD 为1.76%，满足样品分析测试要求。

表3 回收率实验结果Tab.3 The results of recovery tests

2.4 有效部位中总木脂素的含量测定

精密称量毛头牛蒡子有效部位20mg，按“1.3.2”的方法制备供试品溶液，在280nm 波长处测定吸光度，带入“2.2.1”的线性回归方程，计算出总木脂素含量，结果见表4。

表4 总木脂素含量测定（n=3，%）Tab.4 The content of total lignans（n=3，%）

由表4 可见，毛头牛蒡子总木脂素有效部位中总木脂素的含量为95.68 %。

2.5 有效部位中牛蒡苷和牛蒡苷元含量测定

精密称量毛头牛蒡子有效部位20mg，按“1.3.4”方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算样品含量，结果见表5。

表5 牛蒡苷和牛蒡苷元含量测定（n=3，%）Tab.5 The content of arctiin and arctigenin（n=3，%）

由表5 可见，毛头牛蒡子总木脂素有效部位中牛蒡苷含量为55.71%，牛蒡苷元含量为2.99%。

3 结论

本实验采用确定的最佳提取和富集工艺进行制备毛头牛蒡子总木脂素有效部位，并且采用冷冻干燥技术干燥收集的洗脱液。对所制备好的毛头牛蒡子总木脂素有效部位进行化学成分分析，先采用紫外可见分光光度法测定其总木脂素的含量，测得含量为95.68%。再参考相关文献［7］，对流动相进行选择、对洗脱程序进行优化，对毛头牛蒡子总木脂素有效部位中牛蒡苷、牛蒡苷元的含量进行测定，其中，牛蒡苷含量为55.71%、牛蒡苷元含量为2.99%。对毛头牛蒡子总木脂素有效部位中总木脂素类成分和主要活性成分牛蒡苷、牛蒡苷元的定性定量分析，为后期有效部位的抗肿瘤活性研究提供了相关研究数据。