双酚A暴露对不同卵巢储备状态女性优质胚胎率的影响

高敏，迪丽尼格尔·阿吉阿布都拉，罗杰，高义凡，杜丽丽，黄凯，沈豪飞，2，谷旭照，贾天玉，2*，王一青，2，3*

(1.兰州大学第一临床医学院,兰州 730000;2.兰州大学第一医院,兰州 730000;3.甘肃省生殖医学与胚胎重点实验室,兰州 730000)

人类生产活动过程中大量有毒有害物质被排入外界环境,不仅对环境造成了污染破坏也对人类自身造成了严重的安全隐患。其中有一类可以改变内分泌系统功能从而对生物体及其后代造成不良影响的物质被世界卫生组织定义为环境内分泌干扰物[1],这类物质可表现出雌激素活性或抗雌激素活性进而影响女性生殖系统,导致月经周期不规律、生育力降低、多囊卵巢综合征(PCOS)、子宫内膜异位症、卵巢早衰、性早熟和不良妊娠结局等多种生殖问题[2-4]。双酚A(bisphenol A,BPA)作为一种常见的工业原料被广泛用于各种工业用品的生产且在空气、水源、土壤中均被检测到,在人类的生物样本中如血清、尿液、胎盘组织、乳汁中也发现其存在[5-6]。

BPA通过摄食、吸入和皮肤接触等方式进入人体,通过与雌激素受体α、β及雌激素相关受体γ结合来模拟雌激素从而干扰性激素的正常释放和起效,影响女性生殖系统的发育和功能[7-8]。研究表明,BPA暴露可导致雌性发情周期异常、妊娠率降低、类固醇激素如雌二醇(E2)、孕酮(P)和睾酮(T)分泌紊乱,并且Star、Cyp11a1、Cyp17a1等激素合成相关酶的表达也出现失调[9-10]。卵巢作为女性重要的生殖器官对其生育年限具有决定性作用,任何对卵巢的损伤都有可能对其生育力甚至后代产生严重影响。卵巢储备功能减退(DOR)和PCOS表现为卵泡数量的两个极端,体现出不同的卵巢储备状态,为了探究BPA在不同卵巢储备状态人群内的暴露水平与其优质胚胎率的关系,本研究检测了卵巢储备功能正常(NOR)、DOR及PCOS患者卵泡液内BPA浓度并进行了相关于体外受精周期中优胚率的分析。

资料和方法

一、研究对象

2022年1—6月于兰州大学第一医院生殖中心行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的患者。

纳入标准：临床信息记录完整;采用高孕激素状态下促排卵(progestin primed ovarian stimulation,PPOS)方案;有冻存卵泡液样本的NOR、DOR和PCOS病例。

DOR诊断标准[11-12]：月经第2～3天卵泡刺激素(FSH)≥10 U/L,抗苗勒管激素(AMH)<1.1 ng/ml,窦卵泡计数(AFC)<5～7个;满足以上两项。PCOS诊断标准[13-14]：具有雄激素过多的临床症状,稀发排卵或无排卵,卵巢多囊样改变即一侧卵巢存在12个及以上直径为2～9 mm的卵泡;满足以上两项。

排除标准：腹腔手术史;年龄大于40岁;子宫内膜异位症史;染色体异常;3个月内有抗生素治疗史;甲状腺疾病史;自身免疫性疾病史。

共纳入了符合标准的164例患者,其中NOR组80例、DOR组39例、PCOS组45例。

本研究经兰州大学第一医院伦理委员会审核批准(LDYYLL2022-95)。

二、研究方法

1.主要试剂与设备：双酚A ELISA检测试剂盒(江苏晶美生物);离心机(上海卢湘仪);酶标仪(帝肯,瑞士)。

2.卵泡液样本采集：本研究纳入病例均采用PPOS促排卵方案,于月经第2～4日口服甲羟孕酮片(MPA,每片2 mg;浙江仙据制药) 10 mg/d,同时肌肉注射尿促性腺激素(HMG,每支75 U;珠海丽珠制药)150～300 U/d,经阴道超声检查卵泡发育,根据E2、黄体生成素(LH)、P水平及卵泡大小皮下注射人绒毛膜促性腺激素(HCG,每支2 000 U;珠海丽珠制药) 6 000～10 000 U。HCG注射36 h后取卵。收集第一管清亮、未染血的卵泡液,3 000 r/min离心15 min,吸取上清液分装后放置于-80℃冰箱保存。

3.受精/胚胎培养及评级：取卵后根据男方精液情况选择常规体外受精(IVF)或卵胞浆内单精子注射(ICSI)进行授精,16～18 h后观察到有双原核(2PN)即为受精成功。受精3 d后,卵裂期胚胎根据卵裂球数目、形态、有无多核及碎片程度进行胚胎评级,分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级。优质胚胎为Ⅰ级和Ⅱa级的胚胎,即卵裂期胚胎细胞数为6～8个、分裂均匀、碎片≤25%且无多核者[15]。优质胚胎率=优质胚胎数/2PN数×100%。

4.BPA检测：采用商用试剂检测盒(江苏晶美生物),在标准孔内分别加入0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、8.1 ppb标准品溶液50 μl;将卵泡液样本解冻至室温,在样品孔内加入50 μl卵泡液;在所有孔内加入50 μl抗BPA抗体酶结合物并轻轻晃动反应板;37℃孵育30 min后弃去孔内液体,用洗涤液清洗各个反应孔后完全除去孔内液体;在每孔内依次加入50 μl显色液A和50 μl显色液B,晃动混匀;37℃孵育10 min后每孔加入50 μl终止液,混匀,使用酶标仪在450 nm下检测吸光度。

三、观察指标

患者一般资料,包括年龄、体质量指数(BMI)、不孕年限、初潮年龄、月经周期、基础激素水平(包括FSH、LH、E2)及AMH水平、AFC;获卵数;卵泡液BPA检测结果;受精方式及胚胎培养结局。

四、统计学分析

结 果

一、不同人群组基本临床资料

本研究共纳入了164例病例,其中NOR组80例、DOR组39例、PCOS组45例。

与NOR组比较,PCOS组年龄较小、而DOR组年龄较大(P<0.05);与DOR组比较,PCOS组年龄较小(P<0.05)。3组间BMI、不孕年限、月经初潮年龄比较无显著差异(P>0.05),而PCOS组月经周期天数显著长于NOR组和DOR组(P<0.05)。3组间AMH和基础FSH水平比较均有显著差异(P<0.05),其中PCOS组AMH最高而基础FSH水平最低,DOR组AMH水平最低而基础FSH水平最高。PCOS组基础LH水平显著高于NOR组和DOR组(P<0.05)。3组间基础E2水平比较无显著差异(P>0.05)(表1)。

3组间AFC、获卵数比较均有显著差异(P<0.05),其中PCOS组最高、DOR组最低。3组间受精方式占比无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 三组人群基本临床资料[(-±s),M(Q1,Q3),%]

二、不同人群卵泡液中BPA暴露水平

本研究共收集了164份卵泡液样本,其中NOR组80份、DOR组39份、PCOS组45份。PCOS组卵泡液BPA含量显著高于DOR组(P<0.05);DOR组和PCOS组卵泡液BPA含量与NOR组比较均无显著差异(P>0.05)(表2)。

表2 三组人群卵泡液内BPA水平

三、不同人群BPA水平与优质胚胎率的关系

1.NOR组卵泡液BPA水平与优质胚胎率的关系：纳入NOR病例80例,其对应的卵泡液中BPA浓度根据四分位数法分为Q1(0.02～0.97)、Q2(1.31～5.28)、Q3(5.91～9.12)、Q4(9.50～12.25)亚组。NOR组各BPA浓度亚组间优质胚胎率存在显著差异(P=0.027),其中Q2亚组相较于Q1亚组优质胚胎率显著下降(P<0.05)(表3)。

表3 NOR组卵泡液BPA水平与优质胚胎率的关系

单因素Logistic回归分析显示NOR组卵泡液BPA水平对优质胚胎率无显著影响[OR(95%CI)=1.02(0.96,1.08),P=0.589 7]。

2.DOR组卵泡液BPA水平与优质胚胎率的关系：纳入DOR病例39例,其对应的卵泡液中BPA浓度根据四分位数法分为Q1(0.02～1.27)、Q2(1.63～4.76)、Q3(6.19～8.87)、Q4(9.94～12.03)亚组。DOR组间各BPA浓度亚组间优质胚胎率无显著差异(P=0.488)(表4)。

单因素Logistic回归分析显示DOR组卵泡液BPA水平对优质胚胎率无显著影响[OR(95%CI)=0.95(0.86,1.04),P=0.278 3]。

表4 DOR组卵泡液BPA水平与优质胚胎率的关系

3.PCOS组卵泡液BPA水平与优质胚胎率的关系：纳入PCOS病例45例,其对应的卵泡液中BPA浓度根据四分位数法分为Q1(0.56～1.25)、Q2(1.33～5.67)、Q3(6.78～9.00)、Q4(9.35～12.52)亚组。PCOS组各BPA浓度亚组间优质胚胎率存在显著差异(P=0.004),其中Q2和Q4组相较于Q1组优质胚胎率均有显著下降(P<0.05)(表5)。

表5 PCOS组卵泡液BPA水平与优质胚胎率的关系

单因素Logistic回归分析显示PCOS组卵泡液BPA水平对优质胚胎率无显著影响[OR(95%CI)=0.96(0.88,1.04),P=0.314 1]。

讨 论

BPA可用于制造聚碳酸树脂和环氧树脂,而这些物质被大量用于塑料袋、食品外包装(如罐头内层)、医疗器械、热敏纸的生产[16-18]。它的主要摄入途径是饮食,并可在运输及储存过程中经食品容器渗入食物中,而加热和酸性环境则会加快该过程,一旦其进入人体便可经胃肠道吸收,在肝脏代谢,最终从尿液排出[19-20]。雌激素可调控胚胎在发育过程中靶器官的功能,若在胎儿期和围产期这两个窗口期受到具有雌激素活性的BPA的污染便会导致其个体成年后的生殖损伤[21],这一依据使得研究BPA早期暴露与女性生殖疾病的关系具有重要意义。卵泡液作为卵泡生长的微环境,可更直观地研究卵泡生长发育过程中的影响因素,因此有必要对不孕女性卵泡液内的BPA暴露程度进行研究。

PCOS是一种育龄期女性常见的内分泌紊乱疾病,全球发病率约为6%～20%,表现为胰岛素抵抗、多毛、肥胖、卵巢多囊化、月经不规律[22]。患者较低的FSH水平会抑制卵泡的成熟,导致卵泡生长停滞、多囊化卵巢形成和少或无排卵,同时大量被抑制生长的窦前卵泡使得AMH水平升高,进一步导致高雄激素血症[23]。而DOR患者由于较低的卵巢反应常被认为是辅助生殖治疗中的一大难题,其最明显的特征是卵泡储备数量减少并表现出FSH水平升高和AFC及AMH水平的降低[24]。这两类人群的卵泡储备数量表现为两个极端,体现出两种不同的卵巢储备状态,并且她们的激素水平也有着很大的差异。我们的研究结果体现了这些特点。

Prabhu等[25]在最近的研究中发现,PCOS人群的血浆BPA水平显著高于对照组人群[(4.1±1.3) μg/g_cr vs.(3.3±1.2) μg/g_cr,P<0.05],且相较于低水平BPA暴露女性,高水平BPA暴露女性体内的类固醇激素、亚麻酸、亚油酸等物质的合成出现了紊乱。在另一项针对青少年人群的研究中也同样发现PCOS组BPA水平相较于正常人群显著增高[(15.89±1.16)μg/g_cr vs.(7.30±1.38)μg/g_cr,P<0.05][26]。在本研究中,PCOS组卵泡液的BPA浓度高于NOR组和DOR组,这与上述研究的结果相似。此前已有研究表明BPA可通过增加P450c17、P450scc、Star等类固醇激素合成相关酶的表达,影响卵巢卵巢类固醇激素的生成,而这些酶也与PCOS表现出来的高雄激素血症有关[27-28]。另一方面,BPA也与肥胖和胰岛素抵抗有着密切的关系,它可通过扰乱正常的脂质与葡萄糖稳态改变机体的代谢,而这种效应甚至可以影响其子代。研究显示,BPA浓度与超重和肥胖风险呈正相关,相较于非肥胖人群,肥胖人群体内的BPA浓度更高,而且女性比男性表现得更加明显[29-30]。同时,长期暴露于BPA会导致葡萄糖稳态的失调,使胰岛素慢性高分泌降低葡萄糖水平并随后出现胰岛素抵抗[31],以上这些代谢综合征正是PCOS人群常见的症状。此外在关于DOR人群研究中显示DOR组体内的BPA含量显著高于对照组[(1.89±2.17)μg/g vs.(1.58±1.08)μg/g,P<0.05],且在45岁以下的女性中BPA浓度与AMH呈负相关[32]。AMH作为目前评估卵巢储备功能的生物标志物,其浓度的降低与卵巢低反应性有关,DOR人群中BPA浓度的升高也在某种程度上说明了其与卵巢衰老的相关性[33]。另一项关于早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)人群的调查同样显示POI人群的BPA水平要略高于正常人群[34]。并且BPA暴露可通过提高卵巢颗粒细胞ROS生成水平、促进Ca2+积累、降低抗氧化能力、诱导细胞凋亡和自噬等多种机制造成卵巢激素分泌紊乱和排卵功能障碍[35-37]。

本研究分析了在不同卵巢储备功能人群中BPA浓度与优质胚胎率的关系,尽管结果显示BPA浓度与优质胚胎率无显著的相关性,但是在NOR人群和PCOS人群的亚组分析中发现,相较于卵泡液BPA浓度更低的人群,BPA浓度更高者的优质胚胎率出现了显著下降。有研究者收集了接受IVF治疗的女性的尿液样本,并在后续的分析中发现随着尿液中BPA浓度的增高,卵母细胞回收率、成熟率和胚胎着床率显著降低[35]。在Ehrlich等[38]的报道中,BPA浓度增加与成熟卵母细胞减少和受精率降低也存在显著的线性剂量关系。而在另一项研究中则显示尿BPA浓度与胚胎着床率和MⅡ卵母细胞数显著负相关,与优质胚胎、受精率、妊娠率无显著相关[39]。在体外试验中,BPA暴露可显著抑制卵泡生长、降低窦状卵泡百分比、减少卵母细胞成熟率并增加闭锁卵泡率,这些改变可能与卵母细胞减数分裂后期纺锤体异常、染色体排列错误、减数分裂停止甚至非整倍体形成有关[40-42]。这些数据都表明BPA对于胚胎存在着一定的不良影响。此外,在本研究中,NOR组与DOR组的卵泡液BPA含量并无显著差异,而PCOS组的BPA含量则显著升高,而且在DOR组各BPA浓度亚组间优胚率并未观察到显著差异,这也提示或许不同卵巢储备状态的人群对于BPA的易感度也有所差异。

考虑到BPA较短的半衰期,为了提供更加精准的结果,在开展相关研究时应注意样本收集的窗口期及受试者近期摄入BPA的情况。同时考虑到某些特殊职业人群(如收银员)会日常接触BPA,应针对该类人群尽早实施防护措施,减少BPA对公共健康安全的危害。

综上所述,BPA作为一种毒性物质对女性生殖健康的威胁不容忽视,积极研究其对女性生殖疾病的关联与损伤机制并加强对该物质的风险管理对保障女性生殖健康具有重要的科学意义和社会意义。