波塞冬1组患者重复周期应用早卵泡期长效长方案和拮抗剂方案的疗效比较及自身对照研究

明子琳，李婉晴，唐志霞，洪名云

(安徽医科大学附属妇幼保健院,安徽医科大学第五临床医学院,合肥 230000)

卵巢低反应(poor ovarian response,POR)指卵巢对促性腺激素(Gn)刺激反应不良,主要表现为卵巢刺激周期发育卵泡少、血雌激素峰值低、Gn用量多、周期取消率高、获卵数少和临床妊娠率低[1]。据报道,控制性促排卵(COH)方案中POR的发生率为9%～24%[2],POR影响体外受精(IVF)患者的预后。临床实践中POR人群存在较大异质性,处理策略需要个体化,不同类型患者如何进行管理值得临床医生探讨。为了改善低预后患者妊娠结局,帮助临床制定合理的管理策略,2016年波塞冬小组制定了低预后人群的分组标准。按照波塞冬标准,将年龄<35岁、卵巢基础窦卵泡数(AFC)≥5枚、抗苗勒管激素(AMH)≥1.2 ng/ml、COH获卵数≤9枚的患者定为波塞冬1组[3]。波塞冬1组患者的卵巢储备功能正常,在常规COH方案中却发生非预期卵巢低反应(unexpected poor ovarian response,uPOR),导致卵母细胞数量减少、IVF预后不良。文献报道,常规COH方案中波塞冬1组人群发生率为31.81%[4]。波塞冬1组患者重复周期如何通过优化COH方案来提高卵巢反应性、改善患者预后是临床医生面临的问题。本研究对采用早卵泡期长效长方案或拮抗剂方案IVF/ICSI周期助孕失败的波塞冬1组患者重复周期COH的结果进行回顾队列研究分析,同时对前后两个周期中均采用相同COH方案的结果进行自身对照分析,旨为波塞冬1组患者重复周期制定COH策略提供指导。

资料与方法

一、研究对象

收集2018年6月至2022年6月于安徽省妇幼保健院生殖中心行早卵泡期长效长方案或拮抗剂方案IVF/ICSI周期失败的波塞冬1组不孕患者的临床资料。

纳入标准：(1)符合波塞冬1组标准[3]：年龄<35岁;AFC≥5枚,AMH≥1.2 ng/ml;常规COH方案获卵数≤9个;(2)再次COH采用早卵泡期长效长方案或拮抗剂方案;(3)两个周期间隔在3月至1年内。

排除标准：(1)多囊卵巢综合征;(2)输卵管积水未处理者、重度宫腔粘连、重度子宫内膜异位症及腺肌症、自身免疫性疾病等;(3)男方行附睾或睾丸穿刺术者及重度少弱畸精子症;(4)夫妇任何一方染色体异常患者。

共纳入286例患者(286周期)。根据再次COH方案不同将患者分为两组：拮抗剂方案组167例(167周期);早卵泡期长效长方案组(简称早长方案组)119例(119周期)。同时将其中前后两个周期均采用相同COH方案的124例患者分为两组：双早长方案组70例(70周期),双拮抗剂方案组54例(54周期)。

二、研究方法

1.COH方案—拮抗剂方案：月经周期第2～3天阴道B超检查无直径>8 mm卵泡时,开始给予重组人卵泡刺激素(rFSH;果纳芬,默克雪兰诺,瑞士)或尿促卵泡素(丽申宝,珠海丽珠)150～300 U/d,促性腺激素(Gn)使用4～5 d后根据卵泡生长及血清生殖激素水平调整Gn剂量和剂型。血黄体生成素(LH)水平<1.2 U/L或卵泡生长出现慢反应时,及时添加尿促性素(HMG,珠海丽珠)或重组人促黄体激素α(乐芮,默克雪兰诺,瑞士)75～150 U/d。当卵泡直径≥14 mm或血清雌二醇(E2)水平≥1 100 pmol/L,开始注射醋酸西曲瑞克(思则凯,默克雪兰诺,瑞士)0.25 mg/d,至注射人绒毛膜促性腺激素(HCG,珠海丽珠)日止。当至少2个卵泡直径达18 mm或3个卵泡直径达17 mm时,给予HCG 6 000～10 000 U注射,扳机后36 h左右取卵。按照本中心实验室常规进行IVF/ICSI授精、胚胎培养及评分[5]。不符合新鲜周期移植条件的患者将其可用胚胎玻璃化冷冻,择期行冻融胚胎移植(FET);符合新鲜周期移植条件的患者于取卵日口服地屈孕酮片(雅培,荷兰)10 mg tid及阴道给予黄体酮阴道缓释凝胶(雪诺同,默克雪兰诺,瑞士)90 mg进行黄体支持。重复周期拮抗剂方案的优化措施：Gn启动量在第一周期基础增加75～100 U。

2.COH方案—早卵泡期长效长方案：在前一月经周期第2～3天注射促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a;达菲林,益普生,法国,或抑那通,武田药品,日本)3.75 mg后,28～35 d后检查血FSH、LH、E2水平及子宫内膜厚度,达到降调标准即启动Gn,采用果纳芬或丽申宝150～300 U,同时添加HMG或乐芮75 U。Gn使用4～5 d后根据卵泡生长及激素水平调整药物。扳机标准及后续治疗同拮抗剂方案。重复周期早卵泡期长效方案的优化措施：Gn启动日开始添加HMG或乐芮75 U;启动Gn时机除达到上述降调标准外,同时AFC直径须达到4～5 mm;Gn启动量在第一周期基础上增加37.5～75 U。

3.妊娠诊断：移植后12～14 d,抽血检查HCG>5 U/L为HCG阳性;移植30 d后B超检查,宫内可见妊娠囊者诊断为临床妊娠;宫内妊娠12周前流产诊断为早期流产。

4.主要观察指标：观察首次及再次COH周期的临床及实验室结果,主要指标包括：Gn总量及天数、LH用量;HCG日E2、LH、孕酮(P)水平及子宫内膜厚度;uPOR再次发生率、中重度卵巢过度刺激综合征(OHSS)发生率、周期取消率(取消原因包括未获卵及无可用胚胎);获卵数、正常受精率、D3可用胚胎数、D3优质胚胎数及优质胚胎率;鲜胚移植临床妊娠率、累计妊娠率及鲜胚移植周期早期流产率等。

计算公式：正常受精率=正常受精胚胎数/成熟获卵数×100%;优质胚胎率=优质胚胎数/正常受精胚胎数×100%;临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%;累积妊娠率=(新鲜周期妊娠例数+解冻周期妊娠例数)/(本周期胚胎已用完例数+胚胎未用完但已妊娠的周期例数)×100%。

三、统计学分析

结 果

一、患者基础资料及IVF/ICSI结局比较

1.基础资料比较：再次COH周期早长方案组与拮抗剂方案组患者间年龄、不孕年限、体质量指数(BMI)、基础FSH和LH水平、AMH水平及AFC比较均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 再次COH周期早长方案组与拮抗剂方案组患者基础资料比较(-±s)

2.助孕结局比较：早长方案组无可移植胚胎患者6例,截止统计日未达到继续妊娠尚有剩余冷冻胚胎的患者5例;鲜胚移植63例中临床妊娠34例,早期流产2例。拮抗剂方案组未获卵患者2例,无可移植胚胎患者7例,截止统计日未达到继续妊娠尚有剩余冷冻胚胎患者4例;鲜胚移植40例中临床妊娠16例,早期流产1例。

早长方案组Gn总量、Gn天数、HCG日E2水平、获卵数、可用胚胎数及优质胚胎数均显著高于拮抗剂方案组(P<0.05),HCG日LH水平显著低于拮抗剂方案组(P<0.05);早长方案组鲜胚移植临床妊娠率及累计妊娠率均有升高趋势,但无统计学差异(P>0.05);两组患者间周期取消率、中重度OHSS发生率、HCG日P水平、HCG日内膜厚度、uPOR再发率、正常受精率、优质胚胎率、鲜胚种植率及早期流产率比较均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 再次COH周期早长方案组与拮抗剂方案组患者IVF/ICSI结局比较[(-±s),%]

二、双早长方案组患者首次与再次COH实验室指标及妊娠结局自身对照比较

70例患者前后两次COH均采用了早长方案(双早长方案)。双早长方案组中,首次早长方案组无可移植胚胎患者11例,鲜胚移植34例中临床妊娠6例、早期流产5例、晚期流产1例;再次早长方案组无可移植胚胎4例,鲜胚移植44例中临床妊娠26例、早期流产2例。

再次早长方案组Gn启动量、LH添加量、HCG日E2水平、获卵数、正常受精率、可用胚胎数、优质胚胎数、优质胚胎率、鲜胚移植胚胎种植率及临床妊娠率均显著高于首次早长方案组(P<0.05),早期流产率显著低于首次早长方案组(P<0.05);两组间周期取消率及中重度OHSS发生率比较均无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表3 双早长方案组患者首次与再次COH实验室指标及妊娠结局自身对照比较[(-±s),%]

三、双拮抗剂方案组患者首次与再次COH实验室指标及妊娠结局自身对照比较

54例患者前后两次COH均采用了拮抗剂方案(双拮抗剂方案)。双拮抗剂方案组患者中,首次拮抗剂方案无可移植胚胎5例、未获卵1例,鲜胚移植19例中临床妊娠1例、早期流产1例;再次拮抗剂方案组患者中无可移植胚胎2例,鲜胚移植18例中临床妊娠10例、早期流产1例。

再次拮抗剂方案组Gn启动量及LH添加量、获卵数、正常受精率、可用胚胎数、优质胚胎数、优质胚胎率、鲜胚移植胚胎种植率及临床妊娠率均显著高于首次拮抗剂方案组(P<0.05);两组间周期取消率及中重度OHSS发生率比较均无统计学差异(P>0.05)(表4)。

表4 双拮抗剂方案组患者首次与再次COH实验室指标及妊娠结局自身对照比较[(-±s),%]

续表

讨 论

控制性促排卵(COH)是IVF过程中非常重要的环节之一,COH中相当一部分人因发生卵巢低反应(POR)降低了IVF成功率,助孕失败及重复治疗增加了患者心理上和经济上的负担。POR与年龄、卵巢储备功能及卵巢反应性等诸多因素相关,临床表现呈多样化、复杂化。2016年波塞冬小组将POR的定义修改为低预后,根据影响IVF预后的相关因素将低预后人群精确地分为4组,其中年龄<35岁、卵巢储备功能正常及常规COH方案获卵数≤9枚的人群定为波塞冬1组人群。该类人群的临床特征为正常卵巢储备功能的非预期卵巢低反应(uPOR)。临床发现,采用常规COH方案波塞冬1组的发生率约占1/3,且uPOR再发风险仍然很高,需要引起高度重视。与博洛尼亚标准不同之处在于,波塞冬标准强调让每个患者获得至少一个整倍体胚胎进行移植所需的卵母细胞数量[6-7],因此对于波塞冬1组患者,重复周期COH目标是获得足量的优质卵母细胞,提高受精率及优质胚胎数以改善IVF预后。

临床诊疗中我们首先要分析POR的原因。uPOR原因较复杂,目前认为可能与以下多种原因相关[8-10]：(1)Gn启动时机不合适,卵泡发育不同步;(2)FSH启动剂量不足,特别是超重或肥胖患者易发生;(3)降调节过深,未及时添加LH成分或LH不足;(4)FSH或LH受体的多态性,导致患者对外源性Gn抵抗及敏感性下降等。波塞冬1组人群uPOR再次发生率较高,本研究中为56.3%(161/286),与代玮等[11]研究结果相仿,提示遗传因素可能是uPOR发生的重要因素。多项研究提示LHβ亚基或LH-CG受体(LHCGR)的多态性影响卵巢对Gn敏感性,导致POR发生[12-14]。有研究表明,LHCGR(p.Asn400Ser)纯合突变可增加空卵泡综合征及不孕的风险,LHCGR(p.Ala449Thr)纯合突变导致LH反应低下及LH抵抗,外源性补充LH有助于改善突变所致的LH抵抗[15-16]。Shi等[17]研究发现,FSHB rs6169基因多态性影响降调节后FSH水平以及卵巢对外源性FSH刺激的敏感性;CC基因型患者的卵巢刺激天数显著低于携带CT和TT基因型的患者,而降调节后的FSH水平高于携带CT和TT基因型的患者,且卵巢刺激所需的FSH剂量随T等位基因的数量增加。以上研究提示我们,对uPOR患者行FSH或LH受体基因多态性筛查可能为临床制定个体促排卵方案、确定初始Gn剂量及促排卵过程中Gn用量调整提供有价值的信息,但目前临床上尚在探索阶段,未广泛应用。

除了以上所述,还有其他与POR相关的风险因素。刘尧芳等[4]研究发现,AMH<2.77 ng/ml、AFC<14枚及 HCG日E2<9 540.33 pmol/L为波塞冬1组发生的风险因素,重复COH应提高警惕。Noli等[18]研究发现,饮食中血糖负荷和碳水化合物摄入增加与uPOR发生的风险显著相关。总之,对于年轻的POR患者,很多潜在原因目前仍然不能完全确定,所以重复周期选择COH方案前需要对可能的原因进行全面评估。

波塞冬1组重复周期COH方案的选择及优化是临床治疗的关键。我国卵巢低反应专家共识[19]及辅助生殖促排卵药物治疗专家共识[20]均建议可先尝试常规COH方案。2020年欧洲人类生殖与胚胎学学会发布的卵巢刺激指南中针对POR人群,长方案和拮抗剂两种方案为同等推荐[21]。王薇等[22]认为,对长方案助孕失败的POR患者来说,重复IVF周期采用拮抗剂方案可以改善胚胎质量及IVF结局。近年来早卵泡期长效长方案(早长方案)因卵泡同步化较好及子宫内膜容受性更佳的优势被广泛用于低反应人群[23]。谢重驹等[24]研究发现,在波塞冬1组患者中,早长方案比拮抗剂方案有更高的卵泡输出率。Li等[25]研究发现,在波塞冬1组患者应用早长方案比黄体中期短效长方案和拮抗剂方案有更高的获卵数、可移植胚胎数、临床妊娠率、活产率及更低的移植周期取消率。本研究结果显示,波塞冬1组患者采用早长方案和拮抗剂方案在周期取消率及中重度OHSS发生率上均无统计学差异(P>0.05);早长方案组鲜胚临床妊娠率、种植率及累积妊娠率有升高趋势,但与拮抗剂方案组相比均无统计学差异(P>0.05);早长方案组Gn总量、Gn天数、HCG日E2水平、获卵数、可用胚胎数及优质胚胎数均显著高于拮抗剂方案组(P<0.05)。我们认为,从安全性和累积妊娠率结果考虑,早长方案和拮抗剂方案均可作为波塞冬1组患者重复周期的备选方案;从获卵数及鲜胚移植临床妊娠率结果考虑,早长方案更优于拮抗剂方案;从经济成本考虑,拮抗剂方案优于早长方案。

早长方案和拮抗剂方案均存在各自的劣势,波塞冬1组患者在应用时需要根据患者的具体情况进一步优化来提高卵巢反应性。早长方案往往存在降调节过深、LH水平不足,重复周期优化的策略包括：(1)启动日开始补充LH制剂;(2)要考虑该类患者可能存在FSH或LH受体基因多态性,适当增加Gn启动量。本研究结果也显示,重复周期早长方案经过优化调整后获卵数、可用胚胎数及优质胚胎数、鲜胚临床妊娠率及种植率均显著高于首次早长方案(P<0.05)。拮抗剂方案存在以下不足之处：(1)因未降调节卵泡同步化差;(2)拮抗剂方案子宫内膜容受性不及早长方案。拮抗剂方案的优化策略包括：(1)Gn启动前一周期预治疗改善卵泡发育同步化[26];(2)加大Gn启动量;(3)及时添加LH制剂;(4)严格把握鲜胚移植指征等。本研究结果表明,经过优化处理后再次拮抗剂方案组的获卵数、可用胚胎数、优质胚胎数、种植率及鲜胚临床妊娠率均显著高于首次拮抗剂方案组(P<0.05)。近年来有学者发现,GnRH-a结合HCG双扳机可改善POR患者卵母细胞质量,提高优质胚胎数[27]。提示双扳机也可以作为拮抗剂方案的优化策略之一。

波塞冬1组患者首次鲜胚移植周期的高流产率也是其低预后的重要原因之一。本研究发现,在双早长方案组中,首次早长方案组早期流产率显著高于再次早长方案组(P<0.05);在双拮抗剂方案组中,首次拮抗剂方案组早期流产率亦高于再次拮抗剂方案组,但未显示统计学差异(P>0.05),可能与样本量少有关。分析具体原因发现,首次早长方案组5例早期流产患者中有2例扳机日LH水平较低、2例移植胚胎质量较差(1例胚胎染色体异常;1例移植1枚D3胚胎提前融合,细胞质不均,呈颗粒状,色深)、1例原因不明,但胚胎未行染色体检测;首次拮抗剂方案组中1例早期流产患者体质量指数超重。学者们认为,uPOR患者鲜胚移植周期高流产率的原因,可能与肥胖、LH不足或LH受体基因多态性等因素影响到卵母细胞和胚胎质量及子宫内膜容受性有关[28-29]。我们的结果也提示,在降低波塞冬1组患者早期流产率方面,重复周期增加LH剂量起非常关键的作用;另外超重或肥胖患者助孕前适当降低BMI可能也是非常有益的。同时,免疫因素及影响子宫内膜容受性相关因素也是值得我们关注和进一步探讨。

辅助生殖技术追求的目标是让患者在最短的时间内获得单个健康新生儿,因此降低鲜胚移植周期取消率是临床上要关注的问题,尤其是以鲜胚移植为优势的早长方案。本研究结果显示,首次早长方案组取消鲜胚移植患者36例,其中无可移植胚胎11例、孕酮升高9例、内膜因素10例、个人因素取消移植6例;再次早长方案组取消鲜胚移植的患者26例,其中无可移植胚胎4例、孕酮升高5例、OHSS高危倾向5例、内膜因素7例、个人因素取消移植5例。文献报道,波塞冬1组患者周期取消率高可能与以下原因有关[30-31]：uPOR导致获卵数量少;卵母细胞成熟度低、颗粒细胞减少及透明带异常使非正常受精几率增加,胚胎质量下降,导致无可移植胚胎;低LH状态下使17羟化酶活性降低,导致孕酮转化为E2速度减慢,孕酮水平升高[32]。在重复周期中临床上可以采取一些优化措施,减少因胚胎因素及孕酮升高导致的周期取消率;重复周期早长方案因OHSS倾向会导致周期取消率增多,因此临床上应做好防控,尽可能提高鲜胚移植率。拮抗剂方案因影响子宫内膜容受性,我中心对拮抗剂方案鲜胚移植指征把握较严格,故周期取消率较高。如何提高鲜胚移植率仍是我们今后工作中需要不断深入探讨的问题。

综上所述,早卵泡期长效长方案(早长方案)和拮抗剂方案均可作为波塞冬1组患者重复周期可选择的方案;从获卵数及鲜胚临床妊娠率结果考虑,早长方案优于拮抗剂方案;从经济成本考虑;拮抗剂方案优于早长方案。临床应用中要针对两个方案的优劣势来采取优化措施来改善COH的反应性及卵母细胞质量和数量等问题,从而改善IVF/ICSI预后。