冷冻精子复苏后授精方式的选择对供精IVF/ICSI助孕妊娠结局的影响

漆雨昕，李丹，胡瑞，杨媛，2*

(1.兰州大学第一临床医学院,兰州 730000;2.兰州大学第一医院生殖医学中心,兰州 730000)

男方因素引起的不育症约占不孕因素的30%～50%[1]。当男性患有非梗阻性无精子症、重度少、弱、畸形精子症及相关基因遗传疾病,使用自身精子可能无法实现临床妊娠或可导致后代罹患遗传性疾病时,可以借助供体精子行体外受精(IVF)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)进行助孕治疗。临床上,供精者往往经过严格筛选,其精子参数远远高于世界卫生组织(WHO)关于男性生育能力最低精子参数的标准[2]。因此,理论上供体精子应该获得令人满意的妊娠结局,然而临床实践中并非如此。

精子冷冻复苏后会出现更高的脱氧核糖核酸(DNA)断裂率[3]、膜脂质组成和顶体状态的变化以及精子活力的降低[4],继而降低了受精率,且胚胎发育停滞、自然流产风险增加[5],最终导致不良的助孕结局。此外,取卵周期获得的卵母细胞质量及数量也是影响授精方式的重要因素。一般情况下,供精夫妇往往选常规IVF-ET受精,但实际操作中发现,解冻后的精液并非全部可行IVF,而且即使精液质量达到IVF标准,若卵母细胞质量异常或患者既往IVF/ICSI周期胚胎质量不好,预测行IVF助孕会导致受精率低下时,临床医生会建议患者选择ICSI或早期补救ICSI(R-ICSI)助孕。据文献报道,IVF周期中受精失败的发生率约为3.5%～20%[6]。ICSI可以绕过卵母细胞对精子的自然筛选过程,从而克服了受精障碍,但在一定程度上会损伤卵母细胞。R-ICSI则可避免受精率低或完全受精失败,但有卵母细胞核质成熟不同步的风险。而授精方式不仅影响受精率还可能影响胚胎发育及妊娠结局。本文旨在通过分析冷冻复苏后精液的不同授精方式对胚胎发育及妊娠结局的影响,以期为供精助孕时授精方式的选择提供临床依据。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2019年1月至2022年7月在兰州大学第一医院生殖中心接受供精助孕治疗的237例患者(共243个取卵周期)的临床资料。

女方纳入标准：(1)因输卵管功能障碍行辅助生殖助孕;(2)体质量指数(BMI)为18～25 kg/m2;(3)无染色体异常。男方纳入标准：因梗阻性无精子症或男方染色体异常或有遗传性疾病而选择供精者。

排除标准：(1)女方本周期未获得卵母细胞者;(2)女方存在内分泌障碍性疾病(糖尿病、甲状腺功能异常等);(3)因女方卵巢早衰、染色体异常等原因接受供卵者;(4)女方存在影响受精及胚胎植入的基础疾病(如未经治疗的输卵管积水、Ⅲ期或Ⅳ期子宫内膜异位症、子宫腺肌症、其他导致子宫内膜病变的疾病、生殖道畸形及女方结核病史等)。

根据精液冷冻复苏后采用授精方式的不同分为3组：IVF组(108个取卵周期)行常规IVF授精;ICSI组(67个取卵周期)行ICSI授精;早期补救ICSI组(R-ICSI组,68个取卵周期)行R-ICSI授精。

本研究经我院伦理委员会审核批准,且进入治疗前所有患者均签署了知情同意书。

二、研究方法

1.控制性卵巢刺激：女方采用早卵泡期长方案或拮抗剂方案进行卵巢刺激,阴道超声下探及2～3个主导卵泡直径≥18 mm时,停止促排,当晚注射人绒毛膜促性腺激素(HCG,珠海丽珠)4 000～10 000 U进行扳机,33～36 h后在B超引导下经阴道穿刺取卵。若患者出现卵巢过度刺激综合征等不适宜胚胎移植的情况时行全胚冷冻。

2.胚胎移植及黄体支持：(1)新鲜胚胎移植：取卵后第3日移植1～2枚卵裂期胚胎或第5日移植1～2枚囊胚。(2)冻融胚胎移植(FET)：平素月经规律、无排卵障碍的患者采用自然周期准备内膜,平素月经不规律、存在排卵障碍的患者采用人工周期准备内膜,当内膜厚度≥7.0 mm、雌二醇(E2)≥732 pmol/L时,同时给予孕激素转化内膜,于第4日行FET。移植后给予阴道放置黄体酮软胶囊(安琪坦;Besins-Healthcare,法国)600 mg/d和口服地区孕酮片(达芙通;苏威制药,荷兰)30 mg/d进行黄体支持。

3.精液处理：供精来源于兰州大学第一医院人类精子库,精液质量符合精子库相关标准和技术规范,供受者血型相符。女方取卵后解冻供精冷冻精液标本。将精子冻存管投入37℃水浴10 min,精液复苏后精子活动率>40%,采用密度梯度离心法获得活动精子。

4.授精方式：(1)IVF：HCG注射后38～40 h,精卵共培养6 h后,去除卵丘颗粒细胞,置于培养液微滴中观察第二极体的排出情况。(2)ICSI：取卵后3～4 h去除卵丘颗粒细胞,对MⅡ卵母细胞进行ICSI,ICSI具体操作过程同R-ICSI。(3)R-ICSI：对于IVF受精6 h后第二极体排出率低于30%,或成熟卵母细胞均未排出第二极体者行R-ICSI。选择形态正常的精子显微注射到MⅡ卵母细胞质中。

5.妊娠结局判定标准：胚胎移植后4周进行阴道超声检查,宫腔内可见妊娠囊者定义为临床妊娠。新鲜胚胎移植或FET后临床妊娠视为本取卵周期妊娠,1次取卵后所获的可移植胚胎全部移植完均未妊娠视为本取卵周期未妊娠。胚胎于宫腔外着床定义为异位妊娠。妊娠14周之前胚胎停止发育或已经发生胚胎死亡并且未自然排出宫腔者定义为胚胎停育。妊娠不足28周或胎儿体质量不足1 000 g而终止妊娠者定义为流产。妊娠28周后分娩活婴定义为活产。

6.观察指标：主要观察指标为累计活产率(CLBR)。CLBR定义为每个取卵周期至少有1次活产的分娩比例,包括所有鲜胚移植和/或FET,直到1次分娩时有活产或直到所有胚胎被使用(二者以先发生的为准),累计活产率=活产周期数/取卵周期数×100%[7]。次要观察指标包括临床妊娠率、流产率、胚胎停育率、异位妊娠率。其中,临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%,流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%,胚胎停育率=胚胎停育周期数/临床妊娠周期数×100%,异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%。

三、统计学方法

结 果

一、患者一般情况比较

本研究纳入了接受供精助孕治疗的237例患者(共243个取卵周期)。根据精液冷冻复苏后采用授精方式的不同分为IVF组(108个取卵周期)、ICSI组(67个取卵周期)和R-ICSI组(68个取卵周期)。

3组患者间年龄、BMI、基础窦卵泡数(AFC)、不孕年限、不孕类型、抗苗勒管激素(AMH)、基础性激素水平比较,均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 三组患者一般情况比较[(-±s),%]

二、供体精液冷冻复苏处理后精液参数比较

ICSI组及R-ICSI组患者精子浓度、活动率、非前向运动精子显著低于IVF组(P<0.05);ICSI组的前向运动精子显著低于IVF组及R-ICSI组(P<0.05),而不动精子显著高于IVF组及R-ICSI组(P<0.05)(表2)。

表2 三组供体精液冷冻复苏处理后精液参数比较(-±s)

三、患者促排卵及胚胎实验室指标比较

3组患者的Gn天数、Gn用量、HCG日E2水平、HCG日孕酮(P)水平、获卵数、MⅡ卵数、2PN数及受精率比较均无显著性差异(P>0.05);ICSI组患者的可利用胚胎数及优质胚胎数显著低于IVF组及R-ICSI组(P<0.05);ICSI组的优质胚胎率略低于其他两组,但无显著性差异(P>0.05)(表3)。

四、患者妊娠结局比较

3组患者进行了鲜胚移植和FET共254个周期。各组间移植胚胎数、移植日子宫内膜厚度及异位妊娠率比较均无显著性差异(P>0.05)。ICSI组临床妊娠率及累计活产率略低于IVF组及R-ICSI组,流产率及胚胎停育率略高于其他两组,但无显著性差异(P>0.05)(表4)。

表3 三组患者促排卵及实验室指标比较[(-±s),%]

表4 三组患者妊娠结局比较[(-±s),%]

讨 论

临床上采用供体精子行助孕治疗时,会有多种因素影响授精方式,如复苏后精液质量,本周期获得卵母细胞数目及质量等。当供体精液解冻后精液质量在正常参考值范围之内,常采用IVF方式授精,若IVF受精率低于30%甚至未受精者,即行短时受精加R-ICSI授精。由于某些供精者存在潜在的影响精液质量的危险因素如生活习惯不良、长期吸烟等,以及精液冷冻过程中的损伤[8],部分供体精液标本在复苏后存在严重少、弱、畸形精子症,可直接采用ICSI助孕。此外,一些卵母细胞质量异常如透明带明显异常的卵母细胞自然受精能力下降[9],或者本周期获卵数少,即使精液复苏后参数达到IVF授精标准,考虑卵母细胞质量情况,选择ICSI或R-ICSI方式授精的情况也时有发生。

ICSI与IVF不同,它需要机械去除卵丘细胞,然后通过显微操作系统将单一精子注射入卵母细胞内使其受精。自1992年以来,ICSI作为克服IVF受精失败的一种手段已被广泛应用,国外多数生殖中心在使用供体精子的助孕周期中常规实施ICSI,以避免精子冷冻损伤可能带来的受精能力低下,但ICSI操作过程对于卵母细胞的损伤不容忽视。Chen等[10]研究报道,对受精后6 h未排出第二极体的卵母细胞进行R-ICSI,获得了较高的妊娠率,且该研究是R-ICSI的首次报道。R-ICSI技术可以显著提高受精率,改善成功妊娠的概率,但由于卵母细胞暴露时间过长无法保障核质发育的同步性,进而影响后续胚胎发育。

在本研究中,ICSI组及R-ICSI组患者精子浓度、活动率、非前向运动精子显著低于IVF组(P<0.05);ICSI组的前向运动精子显著低于IVF组及R-ICSI组,而不动精子显著高于IVF组及R-ICSI组(P<0.05),3组供体精液冷冻复苏处理后精液质量大部分达到正常标准。由于冷冻-解冻过程会降低精子质量,且冷冻前供精者精液质量不同,解冻复苏后精液质量参差不齐,为保障良好临床结局,临床医生常采用ICSI及R-ICSI提高受精率并获得可用胚胎。Ozimic等[11]研究证实了冷冻-解冻程序会改变新鲜精子的活力,张宏展等[12]证明了前向运动精子总数降低对受精失败有一定的预测价值,并建议前向运动精子总数较低的患者行ICSI或R-ICSI助孕以避免受精失败。

精子的冷冻-解冻程序对染色质结构有损害,导致注射到卵母细胞后精子细胞核去凝的潜在风险,从而降低胚胎发育潜力[13]。有研究证实精液解冻后DNA碎片指数(DFI)显著高于冷冻前[3],DFI是评估精子DNA完整性的指标,表示精子DNA的受损情况。Li等[14]研究发现高DFI患者行IVF/ICSI助孕时胚胎发育潜力差。这与本研究结果相似：3组患者间受精率无显著性差异(P>0.05),但ICSI组患者的可利用胚胎数及优质胚胎数显著低于IVF组及R-ICSI组(P<0.05);ICSI组的优质胚胎率虽与其他两组无显著性差异(P>0.05),但有略低于其他两组的趋势。其原因可能是被注射入卵母细胞的精子DNA损伤严重时,胚胎发育过程中可能会出现细胞分裂异常,导致胚胎碎片的形成增加。Asmarinah等[15]得出了相似的结论,即精子染色质的成熟度低和完整性差可能会影响ICSI后的受精卵发育。此外,ICSI操作过程会增加损伤卵母细胞的机会并改变卵母细胞蛋白质组学[16],进一步影响胚胎发育。Wiener-Megnazi等[17]研究发现在使用供体精子进行助孕治疗的患者中,相较于IVF授精,ICSI的使用与较低的优质胚胎率有关。

本研究中,ICSI组在取卵后3～4 h去除卵丘颗粒细胞,R-ICSI组在取卵后6 h去除。有研究认为,卵母细胞中细胞质成熟的时间晚于细胞核成熟的时间[18];Falcone等[19]发现在取卵后5～6 h卵母细胞的细胞核质发育同步,这一时间段进行ICSI可获得良好的胚胎质量和妊娠率。本研究中,ICSI组的胚胎质量略低于R-ICSI组可能与培养时间过短、注射卵母细胞核质成熟不同步有关。R-ICSI的时间优势可以预防卵母细胞的不完全成熟,保证了胚胎质量及胚胎正常发育。此外,卵丘细胞可为卵母细胞提供糖胺聚糖、类固醇激素和营养素等因子,这些因子对卵母细胞的核质成熟、受精和发育起着关键作用[20]。R-ICSI操作中,卵丘细胞与卵母细胞接触时间较长,卵母细胞成熟度较高,具有更好的发育潜能,更有利于成功受精和胚胎发育。

本研究结果表明,R-ICSI组患者精液质量低于IVF组,但与短时受精相比,R-ICSI患者的胚胎发育及妊娠结局均无显著差异(P>0.05)。这与Huang等[21]的结论相似。贺慧等[22]研究认为,与IVF组相比,R-ICSI并未影响试管婴儿助孕结局,其可作为短时受精失败的预防措施。蒋彦等[23]的研究得出了相似结论：使用供体精液的夫妇IVF受精失败后,R-ICSI的方法可使患者获得较好的妊娠结局。

ICSI组的临床妊娠率及累积活产率略低于IVF组及R-ICSI组,流产率及胚胎停育率略高于其他两组,但可能由于纳入样本量较少,尚未表现出显著性差异(P>0.05)。之前吴丽敏等[24]的研究中,ICSI组与R-ICSI组的妊娠结局亦无统计学差异,但ICSI组的累计活产率略高于R-ICSI组。这可能是因为纳入的患者人群不同,吴丽敏等[24]的研究关注的是使用夫精的不孕患者,并无冷冻保存对精液造成损伤;而我们的研究集中于供体的冷冻精液。本研究结果证明使用ICSI助孕并不能提高冷冻损伤精液的临床妊娠结局。

本研究也存在一些不足：首先,仅纳入了单个生殖中心的数据,样本量较小;其次,未随访子代的健康情况;最后,本研究为回顾性研究,研究结论可能存在一定的局限性,后续应开展更大样本量的前瞻性研究加以探讨验证。

综上所述,辅助生殖技术的成功取决于精子和卵母细胞的质量,供体精液冷冻复苏后必须得到适当处理以获得高质量的精子,但冷冻损伤不可避免,进而影响受精、胚胎发育及妊娠结局;其次,卵母细胞的质量及数量也无法精确把控,因此授精方式的选择至关重要。临床工作中即使复苏后精液质量达到行IVF授精的标准,但因卵母细胞质量及临床医生经验不同选择ICSI或R-ICSI授精的情况不在少数。本研究结果提示冷冻精子复苏后行IVF及R-ICSI助孕的胚胎质量及累计活产率有优于ICSI的趋势,因此建议行供精助孕治疗时优先选择IVF授精,当存在卵母细胞因素或其他因素预测IVF受精率低下时可行R-ICSI以获得较好的妊娠结局。