云南烤烟KRK26 特征香气分析*

张美芬，桑应华，赵红梅，安皓南，吕 芬，赵正雄，李振杰，徐俊驹**

(1.云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650201；2.云南中烟工业有限责任公司 技术中心，云南省烟草化学重点实验室，云南 昆明 650231)

烟草香韵彰显烟叶特色，体现烤烟香型和香气风格特色，对卷烟中香气成分的充分了解有助于卷烟加香加料和卷烟配方的完善[1-4]。KRK26是津巴布韦主栽烤烟品种，也是目前通过全国品种委员会审定的六大外引烤烟品种之一。关于KRK26 的品种适应性[5-6]、栽培管理措施及烘烤技术[7-8]已有许多报道，但有关KRK26 特征香气成分的研究较少，无法与工业可用性建立有效关联，且研究方法较为单一。

烟叶成分种类复杂且含量较低，为了简化且快速聚焦关键香气成分，需要多级、多项分离设备对烟叶香气成分进行有效分割。凝胶过滤色谱法是一种利用分子质量大小分离成分的技术，简便且有效，在食品领域样品前处理过程中有净化作用[9]。分子感官科学是在复杂成分体系中寻找关键成分和特征香气风格的有效手段，近年来国内外烟草科学研究领域也进行了相关研究，如：张启东等[10]确定了初烤烟叶的关键甜味成分物质；迟广俊等[11]利用感官导向分析确定了初烤烟叶的关键酸味成分；茅中一等[12]对福建尤溪烟叶香韵风格的感官辅助凝胶色谱分析明确了其提取物中的重要香气物质。本研究以云南KRK26 的中桔三(C3F)等级烟叶为研究对象，基于感官辅助凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)剖析烟叶关键致香成分，构建烟叶致香成分与其香韵风格特征的有效关联，旨在为烟叶原料开发替代及卷烟叶组配方设计提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：云南KRK26 品种的C3F 烟叶；试剂：无水乙醇、95%乙醇、丙酮(色谱纯)。

1.2 仪器与设备

气相色谱—质谱(GC-MS)分析仪：Agilent 7890A-5975C，凝胶柱(2.0 cm×100.0 cm，填充材料SephadexLH-20)；旋转蒸发仪；水浴锅；电子天平(感量0.001 g)。

1.3 方法

1.3.1溶剂提取方法

将烟叶50.0 g 浸泡于95%乙醇中2 h，料液比1∶10，水浴温度80 ℃，重复提取2 次；将提取的溶液于50 ℃进行蒸馏除去溶剂，浓缩至棕褐色黏稠液体，冷却后得到KRK26 烟叶浸膏。

1.3.2分离方法

取KRK26 烟叶浸膏4.0 g 充分溶于无水乙醇后进行过滤，将过滤后的浸膏加入装填了大孔树脂的色谱柱，使树脂充分吸附后过滤，用纯净水作为洗脱剂，连续冲洗5 个柱体积后，改用乙醇洗脱至洗脱液为无色，然后浓缩乙醇洗脱液；将浓缩物进行GPC 分离，洗脱剂为无水乙醇，每个流份收集时间为30 min、体积为40 mL[13]。

1.3.3感官评价

由10 名经过专业培训的感官评价人员组成评委，通过嗅评的方式对收集到的流份香气特征进行感官评价，并将具有相同香气特征的流份进行合并，组成目标组分进行香韵特征成分分析。

1.3.4香韵特征组分的致香成分分析

将目标组分加压蒸馏、浓缩定容至1.5 mL，加入20 mg/kg 正十七烷40 μL，并经有机针式滤器过滤后转入色谱进样小瓶，采用GC-MS 进行定性分析，同时将各个组分致香成分分为清香、果香、花香、甜香、豆香、焦甜香和其他香气成分等7 种香韵[14]。用于GC-MS 分析的毛细管色谱柱为Agilent J&W Scientific 公司的HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；仪器参数设定为：进样口温度250 ℃，EI 离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，高纯氦气(纯度大于 99.999%)作为载气，柱流速1 mL/min，分流进样，分流比10∶1，进样量1 μL，溶剂延迟3 min；升温程序为：初始温度50 ℃，维持1 min，以5 ℃/min 的速度升至200 ℃，再以10 ℃/min 的速度升至260 ℃，并维持5 min。采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为35～450 amu (m/z)。采用随机顺序进行连续样本分析，避免因仪器信号波动而造成的影响。

1.3.5数据处理与分析

以正十七烷为内标物，计算各香气组分的质量浓度，计算公式为[15]：

式中：C为待测物质的质量浓度，mg/kg；Ai为待测物质的峰面积；A0为正十七烷的峰面积；C0为内标溶液的质量浓度，mg/kg。

香气活力值(odor activity value，OAV)是指香味组分中的某一组分相对浓度与其在某种特定介质中阈值的比值，其大小反映了该组分对某种香味的贡献度，其计算公式为[16-19]：OAV=C/T。式中：T为嗅觉阈值，其值使用Leffingwell &Associates 网站提供的阈值以及文献[20-22]中的阈值，并优先使用最新年份的阈值数据。

通常情况下，OAV 值越大说明该成分致香作用越大，但是由于积分面积归一化法的限制，需引入相对香气活力值(relative odor activity value，ROAV)为新的参数。ROAV 值是某一化合物在整体风格特征的相对贡献度，不需要对每个物质进行绝对定量便可得出香气组分中各个香气成分的贡献度。ROAV≥1 的组分为关键香气成分，0.1＜ROAV＜1 的组分为修饰香气成分，ROAV≤0.1 的组分为潜在风味化合物[23]。ROAV 值的计算公式为：

2 结果与分析

2.1 GPC 流份的感官评价

对GPC 分离得到的23 个流份进行感官评价，得到香韵表现接近的7 个组分，各组分评价结果表明：F1 (流份1～3)和F7 (流份14～23)无明显香气特征；F2 (流份4～5)和F3 (流份6)都有清香香韵，其中，F2 清甜、带有豆香，F3 则以清香为主，辅以花香和干草香香韵；F4 (流份7～9)也能嗅辨出F3 的花香和干草香，但香势上明显加强，同时出现浓烈果香香韵；F5 (流份10～12)以蜜甜香为主，伴随有轻微焦甜香；F6(流份13)焦甜香香势加强，能嗅辨出强烈焦甜香香韵。综合来看，GPC 分离效果较明显。

2.2 致香成分

GC-MS 定性分析结果(表1)显示：茄酮和新植二烯等清香特征物质主要集中在F2、F3 和F4，与其嗅辨中具有清香相符，F2 具有糠酸甲酯和对甲基苯乙酮等果香和豆香香韵特征成分，F3 具有α-亚麻酸和西松烯等特征香气成分，F4 中新植二烯含量较高，具有柠檬醛和香叶醇等特征成分。与F2、F3、F4 相比，F5 中基本不含有清香、果香和花香特征成分，出现了蜜甜香香韵特征成分的苯乙酸以及焦甜香香韵的特征成分，F6 中只出现了具有焦甜香特征的5-羟甲基糠醛和麦芽酚等香气成分。总体而言，清香香韵主要集中在F2 和F3 组分中，焦甜香香韵特征在F5 和F6 组分中，且F6 的焦甜香特征组分更多，这也是能在F6 中闻到强烈焦甜香的原因。F4 组分则有强烈的花香和果香，底部有强烈的干草香。综上所述，F2～F6 不同香韵组分的分析结果与感官评价结果可以进行相互印证。

表1 组分致香成分分析Tab.1 Analysis of aroma components

2.3 致香成分的香气特征

由表2 可知：许多致香成分并不是只具有某种香韵，而兼有其他香韵特征，如：对甲基苯乙酮以豆香为主，兼有花香和果香香韵；糠酸甲酯具有花果香香韵及蘑菇似的香气；金合欢醇具有特有的青香韵铃兰花香气，并有青香和木香香韵[24-25]，这也从侧面反映了烤烟香气的复杂性。

表2 致香成分的香气特征Tab.2 Aroma characteristics of aromatic components

2.4 特征香气成分

由表3 可知：(+)-柠檬烯、柠檬醛、金合欢醇和香叶醇的阈值较低，对风格特征贡献度较大；5-羟甲基糠醛和香草酸的阈值较大，其贡献度较小。各个组分都有彰显自己香韵特征的重要化学成分，如：F2 中有金合欢醇、对甲基苯乙酮和茄酮等香气物质，但糠酸甲酯、新植二烯和金合欢基丙酮等并没有查到相应阈值，这些成分可能会对香气有一定的贡献；F3 中ROAV 值最大的是α-亚麻酸，其次是金合欢醇；F4 的主要香气成分是(+)-柠檬烯、柠檬醛、茄酮和香叶醇等；F5 和F6 的主要香气成分都有5-羟甲基糠醛，此外，F5 还具有蜜甜香香韵的苯乙酸成分，F6 中ROAV值最大的为具有焦甜香香韵特征的麦芽酚。

表3 不同组分致香成分的ROAV 值Tab.3 ROAV values of different aromatic components

2.5 不同组分的主要香气成分和修饰香气成分

F2 组分的主要香气成分是金合欢醇和对甲基苯乙酮，修饰香气成分是角鲨烯、棕榈酸和茄酮；F3 的主要香气成分是金合欢醇和α-亚麻酸，修饰香气成分是(+)-柠檬烯、茄酮和角鲨烯；F4 的主要香气成分是(+)-柠檬烯、柠檬醛、茄酮、香叶醇、棕榈酸乙酯和角鲨烯，修饰香气成分是棕榈酸和巨豆三烯酮；F5 的主要香气成分是苯乙酸，修饰香气成分是5-羟甲基糠醛；F6 的主要香气成分是麦芽酚，修饰香气成分是香草酸和5-羟甲基糠醛。

3 讨论

KRK26 作为六大外引品种之一，如何最大限度发挥原料特点、提高工业可用性一直备受关注，而工业可用性受不同香气风格影响，是不同香韵特征的综合效应，具有复杂的物质基础[26-27]。范幸龙等[28]研究表明：KRK26 以甜香、青香、木香和干草香(清香)为主体香韵，辅以焦香、正甜香和辛香香韵；在清甜香和青香香韵方面多于津巴布韦烟叶，在正甜香、木香、焦香和辛香香韵方面接近津巴布韦烟叶，而在干草香、焦甜香和坚果香香韵方面略低于津巴布韦烟叶。杨康等[29]对丽江种植的KRK26 风格特征评价结果也与之相印证。虽然这些研究可以在一定程度上说明KRK26 的卷烟风格特征，但其主要从烟叶整体感官评价出发，阐明其内在致香成分对香韵特征的贡献值才能更好地凸显香韵风格特征。

研究表明：5-羟甲基糠醛、苯乙酸、棕榈酸、茄酮和新植二烯等物质为清香型卷烟烟气的特征香味成分，对清香型卷烟风格的形成具有重要影响[30]；茄酮与焦甜香韵和焦香香韵、巨豆三烯酮与清甜香韵均呈极显著正相关[31]。此外，烟草中有些香气物质具有特殊的作用，如棕榈酸有甜的蜡脂气息，亚麻酸则会增加烟气刺激性[32]，新植二烯是初烤烟叶中的关键香气成分和增香剂[33-37]。感官评价辅助凝胶分析可用于香韵风格与致香成分的内在关系研究[12]，但致香成分对于整体香韵特征的贡献不仅取决于含量，同时与阈值有较大关系，因此可通过ROAV 值进行综合评价。刘纯友等[38]结合ROAV 值探究各成分对不同类型百香果总体风味的贡献；李欢康等[39]结合ROAV 值，明确了核桃油的关键香气成分构成差异；王丹等[23]利用SPME-GC-MS 和ROAV 值分析了单菌及复配发酵牛乳中关键性风味物质。可见，采用ROAV 值结合感官评价有助于揭示烟叶内在致香成分。

本研究采用凝胶渗透色谱法对烤烟品种KRK26 的提取物进行分离制备，结合感官评价、GC-MS 及ROAV 值，确定了彰显KRK26 风格特征的香韵组分及关键致香成分。原引进的KRK26在津巴布韦具有明显的焦香香韵，但在云南进行推广和种植后，该品种的清甜香韵凸显，总体特征香韵以清香和焦甜香香韵为主，总体秉承了云南烟叶清甜香润的风格特色。

4 结论

本研究以感官辅助凝胶渗透色谱法分析KRK26 的香气风格特征，将其分为7 个不同香韵组分，对有明显不同香韵特征的F2～F6 进行致香成分分析，其中，F2～F3 清香香韵明显，F5～F6则呈焦甜香香韵。KRK26 具有新植二烯、巨豆三烯酮和茄酮等清香风格特征物质，也有5-羟甲基糠醛和麦芽酚等焦甜香型物质，还有香叶醇和金合欢醇等花香香韵以及柠檬醛和(+)-柠檬烯等果香香韵类物质。