基于“肠-脑”相关理论的针刺对偏头痛模型大鼠肠道菌群及中枢炎症的影响＊

孙铭声，陈星宇，2，周梦荻，刘 一，郑宇琦，黄思莹，蔡定均，赵 凌＊＊

（1.成都中医药大学针灸推拿学院 成都 610075；2.成都市中西医结合医院 成都 610041）

偏头痛是一种通常多伴有恶心、呕吐等消化系统兼症的慢性阵发性神经系统疾病[1]，是世界上最普遍和最致残的疾病之一[2]。全世界偏头痛年平均患病率约为14.4%[3]，女性终生患病率则可高达33%[4]。在我国，偏头痛年患病率约为9.3%[5]。脑和肠功能异常是偏头痛的常见病理特征，也是其出现头痛主症和消化系统兼症的关键病理机制。前期基础研究发现，偏头痛频繁发作，会反复激活三叉神经血管系统，使三叉神经颈复合体及丘脑等核团中的中枢性三叉神经血管神经元敏化，可表现为异位性疼痛、痛觉超敏等症状[6-8]。现代医学对于偏头痛多为对症治疗，大多数偏头痛患者都会给予简单的止痛药（例如非甾体类抗炎药和扑热息痛等）[4]。但止痛药物的使用与许多不良反应密切相关（例如胃肠道反应、心脏和肾脏毒性[9]）。针刺防治偏头痛临床疗效显著、副作用少、不良事件发生率低，疗效持续时间长，已被国际医学界初步认可[10]。2021 年一项网状META分析结果证实针刺治疗可有效减轻偏头痛患者的每月头痛天数，与肉毒杆菌神经毒素A、托吡酯的疗效相当，且具有不良事件少等优势[11]。

“肠-脑”相关理论是以“肠-脑”轴为基础的用以阐释肠道与大脑之间的双向神经体液沟通交流的理论，而肠道菌群在其沟通中扮演了关键角色[12]。三代Pacbio全长微生物多样性测序技术是一种全新的肠道菌群检测技术[13]，其结合了一代Sanger 测序的读长优势和二代Illumina测序的高通量优势，将细菌16S全长完全测通，在细菌群落结构分析中具有：覆盖度广、读长长、通量高、物种注释准，能够注释到“种”水平（种水平平均注释率≥60%）等优势[14]。前期已有研究发现三叉神经血管系统的持续激活可能与肠道菌群紊乱密切相关，通过调节肠道菌群可升高偏头痛大鼠痛阈，缓解痛觉过敏症状，提示肠道菌群在偏头痛的治疗过程中起到了重要作用[15]，而针刺研究也发现针刺可针对肠道菌群的丰度及多样性进行有效调节[16-17]。且前期研究发现[18]，偏头痛患者肠道和大脑的相互作用机制与炎症介质（IL-6和TNF-α）密切相关。

因此，本研究采用全新的三代Pacbio 全长微生物多样性测序技术，在明确针刺对偏头痛大鼠镇痛效应的基础上，探讨针刺对偏头痛大鼠肠道菌群与中枢炎症的作用，以期为针刺防治偏头痛的机制提供新的科学证据。

1 实验材料

1.1 动物

雄性同月龄健康SPF 级Sprague Dawley（SD）大鼠共21 只，体重200±20 g，购于成都恩斯维尔生物科技有限公司，实验动物许可证号：SCXK（湘）2019-0004，合格证号：430727200101073785。大鼠饲养于成都中医药大学中药药理学三级实验室动物房，保持12 h 日夜光线循环，自由进食。实验遵照科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》规定。实验方案经成都中医药大学伦理委员会批准（伦理编号：2019-23）。

1.2 试剂与仪器

硝酸甘油注射液（北京益民药业有限公司），0.18 mm×13 mm 一次性无菌针灸针（苏州华佗医疗用品有限公司），电子VonFrey 测痛仪（type 2392，IITC Life Science，Woodland Hills，CA，USA），大鼠IL-6、TNF-α 酶联免疫检测试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司），24孔离心机（德国Eppendorf公司，5424EQ7667 51 型）， 96 well PCR 仪（美国Applied Biosystems 公司，9902 型）等。三代Pacbio 全长微生物多样性测序委托北京百迈客生物科技有限公司完成。

2 实验方法

2.1 动物分组与模型建立

实验前适应性饲养7 天后，测定21 只大鼠的足底机械痛阈值，排除痛阈值距中位数最远的3只大鼠后，采用区组随机法，将18只大鼠随机分为空白组（CONT组）、模型组（NTG组）与针刺组（ACU组），每组各6只。参照Bertels 等[19]及项目组前期较为成熟[20]的造模方法，于第1、3、5、7、9 日采用浓度为5 mg·mL-1的硝酸甘油注射液，以2 mL·kg-1的剂量于NTG 组、ACU 组大鼠颈背部进行皮下注射；共注射5 次，即可成功建立模型；CONT组大鼠皮下注射等剂量生理盐水。

2.2 针刺操作

为避免ACU 组动物针刺后过度挣扎，采用悬挂固定的方式固定大鼠，同时选取双侧“率谷”（位于耳廓尖上方与顶骨结节连线的中点）、双侧“阳陵泉”（后三里上外侧5 mm 处）穴进行针刺干预，取穴标准参照邓春雷等主编的《实验针灸学》[21]等。率谷穴沿皮向颈部刺、阳陵泉直刺，针刺深度约1-2 mm，以每分钟120 次频率小幅度捻转1 min 后，每5 min 行针1 次，共留针15 min，每天1次，连续进行9天。

对NTG 组、CONT组仅进行同样的捆绑固定，不进行针刺。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 电子VonFrey测定足底机械痛阈值

参照Martinov 等[22]的方法，在实验开始前及第1、5、9 天[19]进行足底机械痛阈测定。采用电子VonFrey测痛仪，用硬质针头自下而上垂直刺激大鼠左后爪或右后爪的中央（无肉垫位置），逐渐增加压力，直至观察到大鼠出现明确的疼痛反应（如缩足、抬足、舔舐刺激部位、跳起等）后记录读数。每只大鼠重复测量5 次，然后对最接近5次测量值中位数的3个数值取平均值。

2.3.2 ELISA检测中枢IL-6、TNF-α

第9天治疗结束后，取各组大鼠三叉神经脊束核，冰浴预冷提取缓冲液中研磨匀浆。匀浆50 000 rpm，离心15 min。取上清置-80℃冰箱保存备用。之后严格按酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒说明测定吸光度值，计算各样本IL-6、TNF-α含量。

2.3.3 三代Pacbio全长微生物多样性测序肠道菌群

第9 天治疗结束后，采集各组大鼠粪便样本，使用PowerSoil®DNA Isolation kit 试剂盒提取肠道菌群DNA，检测DNA 浓度＞10 ng·μL-1，并检测抽提的DNA 质量，主带清晰无降解，将提取合格的DNA 作为模板，采用带有Barcode 的16S 全长引物27F 和1492R，以16S rDNA 全长为目的进行PCR 扩增（见表1）。对扩增产物进行定量、纯化、均一化后形成测序文库并进行文库质检，质检合格的文库上机采用PacBio Sequel 上机测序。采用SMRT Link 对下机数据进行校正，得到环形一致性序列（Circular consensus sequencing，CCS）。 再 使 用 Lima 和cutadapt 软件对CCS 进行质量控制，筛除不包含barcode 及长度不在1200-1650 bp 之间的序列，再使用UCHIME 鉴定并去除嵌合体序列，最终完成测序数据的处理。

表1 测序引物名称及序列列表

表2 各组大鼠在不同时间点足底机械痛阈对比（±s，n=6）

表2 各组大鼠在不同时间点足底机械痛阈对比（±s，n=6）

注：与CONT组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与NTG组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别治疗后DAY9 31.03±5.23▲▲18.76±2.53**27.50±2.70▲▲CONT组NTG组ACU组治疗前32.31±3.60 28.84±5.75 32.84±5.53 DAY1 28.30±2.54▲▲19.49±3.98**21.05±6.07**DAY5 30.02±6.79▲▲20.56±1.97**25.13±2.23

2.4 数据处理方法

肠道菌群测序数据，根据97%相似度水平采用USEARCH 对CCS 进行一致性等级聚类以划分OTU。基于OTU 丰度，采用Mothur 分析Alpha 多样性指数（Shannon）。采用Bray-Curtis 算法对所有样本的肠道菌群特征进行Beta 多样性距离计算。采用R 语言进行主坐标分析。在种分类水平上，以SILVA 为参考数据库，利用QIIME 软件生成种水平上的物种丰度表，再利用R 语言绘制物种分布柱状图。采用Lefse（Line discriminant analysis effect size，Lefse）进行组间差异显著物种分析，LDA 阈值设定为4.0，分类水平选择从phylum到species。

采用SPSS 24 软件进行分析，计量资料用均值±标准差（±s）表示，各组数据经过正态检验和方差齐性检验后，组间比较采用单因素方差分析，选用LSD 法对存在的差异进行两两比较；若不符合正态分布或方差不齐时采用非参数方差分析（Tamhane’s T2）法，并采用Boferroni 法对存在的差异进行比较；当P＜0.05 时认为数据有显著性差异。

3 结果

3.1 各组大鼠足底机械痛阈比较

测定大鼠造模前足底机械痛阈，各组间无统计学差异（P＞0.05）。测定大鼠开始造模后第1日足底机械痛阈，结果如表1.图1 显示，与CONT 组相比，NTG 组及ACU 组大鼠痛阈显著下降（P＜0.01）；与NTG 组相比，ACU 组痛阈无统计学差异（P＞0.05）。测定大鼠开始造模后第5 日足底机械痛阈，结果显示，与CONT 组相比，NTG 组大鼠痛阈显著降低（P＜0.01），ACU 组痛阈升高，未出现统计学差异（P＞0.05）；与NTG 组相比，ACU 组痛阈升高，未出现统计学差异（P＞0.05）。测定大鼠开始造模后第9 日足底机械痛阈，结果显示，与CONT 相比，NTG 组大鼠痛阈显著降低（P＜0.01），ACU组痛阈无统计学差异（P＞0.05）；与NTG 组相比，ACU组痛阈显著升高（P＜0.01）。

图1 各组大鼠在不同时间点的足底机械痛阈对比（±s）

3.2 各组大鼠中枢IL-6、TNF-α含量比较

与CONT组相比，NTG组中枢三叉神经脊束核IL-6、TNF-α 含量显著升高（P＜0.01），ACU 组中枢三叉神经脊束核IL-6、TNF-α 含量均无统计学意义（P＞0.05）；与NTG 组相比，CONT 组及ACU 组中枢三叉神经 脊 束 核IL-6、TNF- α 含 量 均 显 著 降 低（P＜0.01）（图2）。

图2 各组大鼠中枢IL-6、TNF-α含量对比

3.3 各组大鼠肠道菌群的结构及丰度比较

3.3.1 物种分类学分析

对筛选后CCS序列在97.0%的相似度水平下进行聚类，最终得到579 个OTU，其中NTG 组509 个OTU，CONT 组489个OTU，ACU 组457个OTU。采用稀释性曲线及评估测序数据质量，结果显示，本次测序的样品丰富度与均匀度足够，可以认为测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种，测序质量合格（如图3）。

图3 稀释性曲线图

通过构建种水平物种分布柱状图，发现鼠乳杆菌、嗜酸乳杆菌等为种分类水平下大鼠肠道菌群的主要组成部分（如图4）。进一步通过统计分析，发现：与CONT 组相比，NTG 组狄氏副拟杆菌（Parabacteroides_distasonis）、Romboutsia_ilealis、罗 伊 氏 乳 杆 菌（Lactobacillus_reuteri）、颤杆菌（Oscillibacter_sp）的相对丰度显著升高（P＜0.05），鼠乳杆菌（Lactobacillus_murinus）、大肠杆菌（Escherichia_coli）、Parasutterella_excrementihominis、丁酸单胞菌属_sp（Butyricimonas_sp）的相对丰度显著降低（P＜0.05）；与NTG 组相比，ACU 组鼠乳杆菌（Lactobacillus_murinus）的相对丰度有 明 显 升 高（P＜0.05），肠 乳 杆 菌（Lactobacillus_intestinalis）的相对丰度显著降低（P＜0.01）（图5）。

图4 种水平物种分布柱状图

图5 种水平物种丰度热图

3.3.2 Alpha多样性分析

采用Shannon 指数以衡量各组物种多样性。研究结果显示，相较于CONT组，NTG 组菌群多样性有上升趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与NTG 组对比ACU组Alpha多样性显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图6）。

图6 Alpha多样性分析（Shannon指数）

3.3.3 Beta多样性分析

在OTU 分类水平上，采用Bray-Curtis 算法对三组样本进行主坐标分析法（Principal coordinates analysis，PCoA）。通过图7 可发现，CONT 组各样本间较为聚集，具有较高的相似度，且与NTG 组相比具有较大的差异度；NTG 组与ACU 组各样本间距离较远，物种组成有一定相似度，但也具有较大的差异度。

图7 PCoA分析-PC1 vs PC2

3.3.4 组间差异显著性LEfSe分析

通过线性判别分析方式在不同组间寻找具有统计学差异的生物标志物，如图8 所示，三组共得到29 个具有显著差异的物种。其中，NTG 组的优势物种主要为梭状芽孢杆菌、梭菌目、嗜酸乳杆菌、毛螺菌科等；ACU 组的优势物种主要为杆菌、乳酸杆菌目、乳酸杆菌科、乳酸杆菌、罗伊氏乳杆菌等。

图8 Lefse差异贡献分析图

4 讨论

偏头痛患者常表现为头部一侧或两侧疼痛，属于中医学“头风”的范畴，按经络辩证当属少阳经病变。《冷庐医话·头痛》云：“头痛属少阳者，上至两角，痛在头角……少阳经行身之侧。”中医学认为，经络“内属于脏腑，外络于肢节”，由于经络与相应脏腑、器官、部位之间的特殊络属和联络关系。循经取穴是基于针灸的治疗作用具有“经脉所过，主治所及”这一最基本规律，选择经过疾病部位或与疾病关系最为密切的经脉上的穴位进行针灸治疗的取穴方法。《黄帝内经》中运用循经取穴原则的处方多达356 首，占其处方总数的86.4%[23]。课题组前期临床研究发现[10]，循少阳经选穴治疗偏头痛可显著减少无先兆偏头痛发作次数，且针刺对偏头痛的治疗具有持续效应（至少可持续至治疗后20 周）。因此，由于偏头痛显著的少阳经病变特征，针灸治疗多循经选取少阳经穴位以疏调少阳经气。本研究在前期临床研究经验的基础上，选取率谷、阳陵泉为治疗主穴。率谷为足少阳胆经腧穴，位于头部，属选穴原则中的近部选穴，《类经图翼》云“率谷……主治脑病，两头角痛，胃膈寒痰，烦闷呕吐”，因此，率谷不单可治疗局部偏头痛，还兼可治疗偏头痛所伴发的恶心、呕吐等消化系统兼症。阳陵泉是足少阳经合穴，是经气深而入里，进而会合于脏腑的部位，其不仅可用于经脉循行所过部位的经络肢节痛，如《备急千金要方·头面第一》所云“阳陵泉主头痛寒热”；还可调节脏腑功能，如《灵枢·顺气一日分为四时》云“经满而血者，病在胃，及以饮食不节得病者，取之于合”。率谷与阳陵泉两穴合用，可调和气血、活络止痛，体现了近治与远治相结合的治疗原则，共同起到疏通少阳经脉以止痛的功效；又兼可调节胃肠道功能，改善胃肠道症状。

在本研究中，项目组采用前期深入阐释其模型机制的硝酸甘油偏头痛大鼠模型[20]，以隔天皮下注射硝酸甘油的方式模拟偏头痛反复发作，从而诱发偏头痛中枢敏化；并以针刺为干预手段，研究了针刺对偏头痛模型大鼠痛觉超敏及肠道菌群的调节作用。结果显示，随着针刺治疗的持续，ACU 组大鼠足底机械痛阈由第一天检测后的与NTG 组无统计学差异（P＞0.05），到第五天检测后的与CONT 和NTG 组均无统计学差异（P＞0.05），再到第九天检测后的与CONT 组无统计学差异（P＞0.05），但与NTG 组具有统计学差异（P＜0.05），体现了针刺随着治疗次数的增加，针刺的累积性效应显著。

前期研究发现，肠道菌群多样性可能与疼痛密切相关[24-25]。本研究结果显示，偏头痛模型大鼠肠道菌群多样性增加，中枢IL-6、TNF-α 含量显著升高（P＜0.05），而针刺可降低偏头痛大鼠肠道菌群多样性，显著增加鼠乳杆菌丰度（P＜0.05），降低肠乳杆菌丰度（P＜0.01），同时显著降低偏头痛大鼠中枢IL-6、TNFα 水平（P＜0.05），使偏头痛大鼠的痛觉超敏得到有效缓解，提示针刺可降低偏头痛模型大鼠肠道菌群多样性，以及调控中枢炎症状态，发挥抗炎镇痛作用。前期研究发现，鼠乳杆菌丰度下降可导致肠道通透性增加，病原菌增殖、活性增强，糖脂代谢紊乱，细胞因子TNF-α、IL-6 分泌水平升高，诱发三叉神经血管系统的激活[26-27]。而肠乳杆菌则与TNF-α、IL-6 的较高水平密切相关[28]，通过摄入肠乳杆菌会导致小鼠血浆IL-6 水平的明显升高[29]。通过服用含乳酸杆菌的益生菌制剂可减少偏头痛发病天数，缓解偏头痛症状[30-33]。而针对本研究中发现的针刺后具有明显增加趋势的阿克曼氏菌的最新研究[34]也指出，阿克曼氏菌具有降低TNF-α、IL-6 等促炎细胞因子的作用，与本研究针刺后可降低IL-6、TNF-α含量的研究结果吻合。

综上，硝酸甘油诱导的偏头痛模型大鼠肠道菌群结构与丰度以及中枢炎症状态与正常大鼠具有显著差异，针刺可对偏头痛模型大鼠肠道菌群发挥良性调节作用，并显著抑制中枢神经系统炎症的激活，缓解偏头痛。但本研究主要从肠道菌群多样性及组成的角度探讨了针刺治疗偏头痛的中枢抗炎镇痛作用，而其“肠-脑”作用途径的中间环节尚不明确。在后续的研究中可引入对肠道菌群的特异性调控手段，并结合宏基因组或代谢组学，进一步明确针刺治疗偏头痛的“肠-脑”作用机制，以深入阐释针刺镇痛的作用新机制。